1 主题内容与适用范围
本标准规定了大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种食品中杂色曲霉素的测定方法。
本标准适用于大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种食品中杂色曲霉素的测定。
2 引用标准
GB/T 5009.22食品中黄曲霉毒素B1的测定方法
3 原理
样品中的杂色曲霉素经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定样品中杂色曲霉素的含量。
4 试剂
4.1 同GB/T 5009.22中3.1～3.4。
4.2 冰乙酸。
4.3 甲酸。
4.4 乙醇(95%)。
4.5 氯化钠溶液(40g/L)。
4.6 三氯化铝－乙醇溶液(200g/L)：称取20g三氯化铝(AlCl3·6H2O)溶于100mL乙醇中，过滤，室温保存。
4.7 杂色曲霉素标准溶液：用杂色曲霉素标准品配制成每毫升相当于10μg的苯溶液。用紫外分光光度计标定其浓度(最大吸收峰的波长325nm，分子量324，摩尔消光系数15200)，并作硅胶薄层色谱纯度鉴定，避光，放置于4℃冰箱中保存。
4.8 杂色曲霉素标准使用液：用苯将10μg/mL的杂色曲霉素标准溶液稀释成每毫升相当于1.0和0.40μg的杂色曲霉素标准溶液。避光，放置于4℃冰箱中保存。
5 仪器
5.1 同GB/T 5009.22中4.1～4.4。
5.2 玻璃板：10cm×10cm与10cm×18.5cm两种。
5.3 展开槽：内长10cm、宽4.5cm、高17cm与内长11.5cm、宽60cm、高19cm。
5.4 玻璃喷雾器。
5.5 空气泵或油泵。
6 分析步骤
6.1 提取
6.1.1 大米、玉米、小麦、黄豆及花生：称取20.00g过20目筛孔的大米、玉米、小麦及黄豆样品(花生样品过10目筛孔)，置于具塞锥形瓶中，加80mL甲醇－氯化钠溶液(90＋10)，振荡30min，过滤。收集样品液40mL(黄豆、花生样品则取20mL，加入20mL提取剂)，移入250mL分液漏斗中，再加入25mL氯化钠溶液(使甲醇与水之体积比为55＋45)和25mL石油醚，振摇2min，静置分层。上层石油醚溶液置锥形瓶中，下层溶液仍移入原分液漏斗中，再用25mL石油醚提取一次。最后将两次上层的石油醚溶液合并，加入25mL甲醇－氯化钠溶液(55＋45)［黄豆、花生样品则加入25mL甲醇－氯化钠溶液(70＋30)］，振摇30s，将下层并于原甲醇水层中，重复用甲醇－氯化钠溶液(55＋45)提取两次［黄豆、花生样品重复用甲醇－氯化钠溶液(70＋30)提取一次］，以提取该层的杂色曲霉素。下层溶液合并后加30mL三氯甲烷(黄豆、花生样品除加三氯甲烷外，再加13mL氯化钠溶液，使甲醇与水的体积比为55＋45)，振摇2min，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层溶液经放有约10g无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于蒸发皿中。于分液漏斗中再加10mL三氯甲烷，重复提取一次，将该下层溶液和用少量三氯甲烷洗滤器的洗液一并放入蒸发皿中。将蒸发皿放置于65℃水浴上挥干，然后再在冰浴上放置2～3min，加1.0mL苯将残留物充分混匀，置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烷移于浓缩管中，于65℃用减压吹气法浓缩至干，加入1.0mL苯，供色谱测定，此1mL大米、玉米及小麦样液各相当于10g样品，1mL黄豆与花生样液则各相当于5g样品。
6.2 测定
6.2.1 薄层板的制备：制备方法同GB/T 5009.22中5.3.1.1，一般用5g硅胶G可制成10cm×10cm，厚度0.3mm的薄层板五块。
6.2.2 点样：取两块10cm×10cm薄层板，在距板下端各0.8～1cm基线上滴加标准使用液与样液如下：距左边缘0.8～1cm处各滴加10μL标准使用液(0.4μg/mL)，在距左边缘4cm处各滴加80μL样液(黄豆、花生样品为40μL)，然后在第二块板的样液点上加滴10μL标准使用液(0.4μg/mL)，在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。
6.2.3 展开：
6.2.3.1 横向展开：展开剂是乙醚－正己烷－苯－三氯甲烷－甲酸(3＋9＋1.5＋1.5＋0.6)15.6mL(由于此混合液不成一相，每一展开槽的用量须单独配制)。用前充分摇匀，一并倒入槽内使用。将靠近标准点的一边，放入槽内展至9cm左右取出挥干。
6.2.3.2 纵向展开：展开剂为苯－甲醇－冰乙酸(90＋8＋2或92.5＋6＋1.5)15mL。将靠近标准点与样液点的一边放入槽内，展开9cm左右取出挥干。
6.2.4 显荧光：在薄层板上喷三氯化铝－乙醇溶液(200g/L)，置80℃加热10min，立即在紫外光灯(波长365nm)下观察结果，待薄层板冷却后再薄薄的喷第二次(不需加热)，可直接观察结果。
6.2.5 观察与评定结果：在紫外光灯下观察，若第二板的第二点在标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板的相同位置上未出现荧光点，则样品中杂色曲霉素含量在5μg/kg以下(黄豆、花生样品为20μg/kg以下)；若出现荧光点的强度与标准点的最低检出量的荧光强度相等，而且此荧光点又同第二板样液的标准点相重叠，则样品中杂色曲霉素含量为5μg/kg(黄豆、花生样品为20μg/kg)；若出现荧光强度比标准点的最低检出量强，则根据其荧光强度估计减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。在喷三氯化铝第一、二次后分别进行观察评定，两次结果应一致。若结果为阳性，则将薄层板放暗处10min，再观察一次，如样品仍为阳性，进一步作确证试验，即在距薄层板(10cm×18.5cm)下端3cm的基线上滴加一个点的10μL标准使用液(0.4μg/mL)与3个点的样液，每点16μL。在样液的一个点上再加滴10μL标准使用液(0.4μg/mL)，另一点上再加滴10μL标准使用液(1μg/mL)。于各点上再加一小滴三氟乙酸，放暗处反应10min，热风吹5min，使薄层板上的温度不高于40℃，用冰乙酸－苯(10＋90)展开1～2次，直至杂色曲霉素衍生物与杂质分开为止。展开时要避光，以下显荧光步骤同6.2.4。最后将板在紫外光灯下观察，如样液为阳性，应产生与杂色曲霉素标准重叠的衍生物。确证法的最低检出量：大米、玉米、小麦为25μg/kg(黄豆、花生样品为50μg/kg)。
6.3 计算
式中：X——杂色曲霉素含量，μg/kg；
V1——样液浓缩后体积，mL；
V2——出现最低荧光样液的滴加体积，mL；
D——浓缩样液的总稀释倍数；
m——浓缩样液中所相当的样品质量，g；
0.004——杂色曲霉素的最低检出量，μg。
结果的表述：报告含量的整数位。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由中国预防医学科学院营养及食品卫生研究所负责起草。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
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