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为了得到发酵石榴汁的优良菌种，并确定石榴酒发酵的工艺参数，从自然发酵的石榴酒醪中分离、纯化石榴酒酵母菌种；通过单因素和正交试验，确定石榴酒发酵的工艺参数。
结果发现，分离纯化的菌种经形态特征和26S rDNA D1/D2 区域序列分析鉴定为酿酒酵母。由此确定的最佳工艺条件为：温度28℃、pH 3.8、糖度为17%、二氧化硫的添加量为100 mg/L，最终发酵的石榴酒的酒度在10%VoL左右。
石榴酒是以石榴为原料，经剥皮、榨汁、发酵、澄清、陈酿而成的果酒。其色泽光亮透明，酒体纯正，酸甜爽口，保留了石榴酸、甜、涩、鲜之天然风味，含有大量氨基酸、多种维生素等，具有很高的营养价值，并有生津化食、健脾益胃、降压降脂、软化血管、保健美容及止泻之功效。
经发酵过的石榴汁抗氧化活性与丁基羧基茴香醚（BHA）相近，明显高于红葡萄酒。中国石榴种植面积迅速扩大，尤其是河南荥阳、卫辉等地形成了大的石榴园，产量已具规模，但是石榴不耐储藏，除鲜食外，每年都有许多果实因不能及时消费和加工而浪费，特别是小果和裂果。
近年来，从天然石榴汁中分离得到了一株高效发酵石榴酒的菌株，通过形态特征和26S rDNAD1/D2 区域序列分析鉴定为酿酒酵母系列。对其发酵工艺参数进行优化，获得了酒体纯正生物功效高的石榴酒生产最佳工艺，并探讨了石榴的综合利用，增加了石榴及其他相关农产品的附加值。对提高石榴经济效益，保护和发展石榴产业有着非常重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
石榴：购自河南省新乡市卫辉。菌种：从石榴汁自然发酵醪中分离。分离及保藏培养基：马铃薯20%，蔗糖1%，石榴汁40%，琼脂2%。菌种鉴定材料：引物NL1（5’—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’）和NL4（5’—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。酵母基因组DNA提取试剂盒（Solarbio 公司），PCR buffer、Tag 酶、dNTP（宝生物工程（大连）有限公司）。
1.2 主要仪器
PCR仪为T—Gradient （德国Biometra公司）。
1.3 方法
1.3.1 菌源的制备取压榨好的石榴全汁置室温进行自然发酵，使石榴汁内的酵母大量繁殖，待有大量气泡并有较浓酒味产生时，即可供分离石榴酒菌源。
1.3.2 菌种的分离、纯化取上述发酵好的石榴酒醪进行梯度稀释，均匀涂布至分离用的琼脂培养基上，22℃—24℃恒温培养36h，挑单菌落培养直至纯化。
1.3.3 菌种的鉴定纯化后的菌株经菌落形态观察和镜检，初步确定为酵母菌。同时，根据酵母菌分类学研究标准方法做分子鉴定。酵母核基因组的提取使用酵母基因组DNA提取试剂盒，按照说明书操作。
使用引物NL1和NL4进行26S rDNA D1/D2区的扩增。PCR 反应液的组成（采用50μL体系）：每管中含PCR缓冲液（10×）5.0μL；25mmol/LMgCl2 3.0μL；10mmol/LdNTP1.0μL；10μmol/LNL1 和NL4 各1ul；0.5 U/ul DNA 聚合酶0.3 μL；10ng/ul —1000ng/ul 模板DNA1.0μL；最后添加ddH2O 定容50μL。PCR循环次序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min20s；循环36次；再72℃延伸8 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由英俊生物技术有限公司测序。
1.3.4 发酵工艺的确定
发酵温度的确定。
将石榴汁的糖度调整为19%，pH调为4.0，添加SO2量为80mg/L。接种等量的石榴酒酵母，分别置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5个温度梯度下培养。待不再有气泡产生时停止发酵，用来测定其残糖和酒精度。
发酵pH的确定。
将石榴汁的糖度通过添加蔗糖调整为19%，添加SO2量为80mg/L，调pH分别为3.8、4.1、4.4、4.6、4.8，接种等量的石榴酒酵母，置于28℃下发酵。待不再产生气泡时停止发酵，测定其残糖和酒精度。
不同糖浓度发酵的试验。
利用蔗糖，将石榴汁的糖度分别调整为13%、15%、17%、19%、21%5个梯度，添加SO2量为80mg/L，调节pH为4.0，接种等量的石榴酒酵母。置于28℃下发酵。待不再产生气泡时停止发酵，测定其残糖和酒精度。
SO2添加量的确定。
将石榴汁糖度调整为19%，pH调为4.0，分别选择SO2的添加量为40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L。接种等量石榴酒酵母，置于28℃下发酵。待不再产生气泡时停止发酵，测定其残糖和酒精度。正交试验因素水平测试。以温度、pH、糖度、SO2的添加量为因素，进行L9（34）正交试验（见表1），以确定各因素的最佳用量。
2 结果与分析
2.1 石榴酒酵母的分离鉴定
从自然发酵的石榴酒醪中分离出的酵母的菌落形态可以看出，所分离菌种的菌落形态特征为：菌落乳白色，圆形较大，中间突起，湿润有光泽，边缘成浸润状。经镜检其细胞为椭圆型，能进行出芽繁殖，符合果酒酵母的典型特征。
经BLAST分析及序列相似性计算，所分离出的被测菌株的26S rRNAD1/D2 区基因序列与模式菌株（U44806）同源性为99.4%，被鉴定为酿酒酵母。
2.2 发酵条件单因素试验结果
在适宜的温度、pH、糖浓度下，酵母菌的生长繁殖和代谢速度都很迅速，较低的pH还可以保证添加的SO2以较多的游离态存在，更好地起到抑制有害微生物的作用。因此，试验对上述参数进行了单因素试验。
通过发酵过程观察发现，发酵温度高，发酵完成快，残糖高，酒精度低，果酒风味不足；发酵温度低，发酵完成较慢，残糖低，酒精度也高。
从不同温度下发酵样品的残糖和酒精度结果来看，26℃是最适的发酵温度。
由不同pH下发酵样品的残糖和酒精度的结果可以看出，不同pH对石榴酒发酵结束的残糖几乎没有影响，在pH4.6时残糖较低，但酒精度也低。在pH3.8时产酒精度最高，在pH超过4.4时虽然也能达到相同的酒精度，但发酵后石榴酒的颜色发黄，失去了原本的深红色，影响石榴酒的外观效果。因此，确定石榴酒酵母发酵的最适为pH3.8。由不同糖浓度下发酵的样品的残糖和酒精度的结果可以看出，随着发酵初糖的提高，发酵结束时的残糖也随之增加，而最终酒精度也逐渐随之增加，在糖度为19%时达到最大，而后又开始下降。
因此，并不是糖度越高，酒精的转化率就越高，过高的糖度可能会抑制酵母菌对糖的利用。这可能是糖度过高时，酵母菌所处环境的渗透压超出了其所耐受的能力，从而抑制了其生理活动。
从试验结果来看，石榴酒酵母发酵的最适糖度为19%。在果酒酿造过程中都会添加一定量的SO2，起到抑制杂菌、护色、澄清、增酸和改善口味等作用。但添加过多会影响酒的风味、抑制酵母菌的发酵及出现酒液中残留硫量超标等危害。由SO2对石榴酒发酵结束的残糖和酒精度的影响可看出，SO2对石榴酒发酵结束时的残糖浓度几乎没有影响，对最终酒精度的影响也较小，均为6%左右，而添加量为80mg/L 时酒精度稍高一点，为6.1%。
2.3 正交试验结果
发酵温度、pH、糖度（%）和SO2的添加量（mg/L）4因素正交试验结果见表2。
由表2 可以看出，对酒精度影响程度的主次顺序为糖度（C）＞ 温度（A）＞pH（B）＞SO2的添加量（D），即糖度、温度和pH 对石榴果酒的酒精度影响较大，而SO2的添加量对石榴酒酵母发酵的影响较小，其最优方案为A2B1C1D3，即温度为28℃，pH为3.8，糖度为17%，SO2的添加量为100mg/L时，石榴酒酵母发酵石榴汁产酒度最好。
3 结论
研究从自然发酵的石榴酒醪里分离出了一株能高效发酵石榴汁的酵母菌种，通过基因组分析初步鉴定为酿酒酵母。
通过正交优化试验，获得了最佳石榴酒酿造条件，并确定了酿造过程中影响酒精度因素为糖度＞温度＞pH＞二氧化硫添加量。
石榴酒艳若朝霞，果香纯正，优雅，更因其独特的食疗保健作用，极具发展潜力，发展果酒符合国家产业政策的要求。而做好研究为石榴酒规模生产提供了重要参考。大力发展石榴果树栽培，选育优良品种，对开发石榴酒等系列产品很重要。
表1 正交试验因素水平
表2 石榴酒发酵工艺的正交试验结果
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