1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法。
本标准适用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定。亚硝酸盐方法检出限为1mg/kg，硝酸盐方法检出限为1.4mg/Kg。
第一篇 格里斯试剂比色法(第一法)
(一)亚硝酸盐测定
2 原理
样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1－萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。
3 试剂
实验用水为蒸馏水，试剂不加说明者，均为分析纯试剂。
3.1 氯化铵缓冲液：1L容量瓶中加入500mL水，准确加入20.0mL盐酸，振荡混匀，准确加入50mL氢氧化铵，用水稀释至刻度。必要时用稀盐酸和稀氢氧化铵调试至pH9.6～9.7。
3.2 硫酸锌溶液(0.42mol/L)：称取120g硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，用水溶解，并稀释至1000mL。
3.3 氢氧化钠溶液(20g/L)：称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1L。
3.4 对氨基苯磺酸溶液：称取10g对氨基苯磺酸，溶于700mL水和300mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。
3.5 N－1－萘基乙二胺溶液(1g/L)：称取0.1gN－1－萘基乙二胺，加60%乙酸溶解并稀释至100mL，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。
3.6 显色剂：临用前将N－1－萘基乙二胺溶液(1g/L)和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。
3.7 亚硝酸钠标准溶液：准确称取250.0mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加100mL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。此溶液每毫升相当于500μg的亚硝酸钠。
3.8 亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0μg亚硝酸钠。
4 仪器
4.1 小型粉碎机。
4.2 分光光度计。
5 操作方法
5.1 样品处理
称取约10.00g(粮食取5g)经绞碎混匀样品，置于打碎机中，加70mL水和12mL氢氧化钠溶液(20g/L)，混匀，用氢氧化钠溶液(20g/L)调样品pH＝8，定量转移至200mL容量瓶中加10mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2～5mL氢氧化钠，混匀。置60℃水浴中加热10min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5h，用滤纸过滤，弃去初滤液20mL，收集滤液备用。
5.2 测定
5.2.1 亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0，2.5，5，10，15，20，25μg亚硝酸钠)，分别置于25mL带塞比色管中。于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液，加2.5mL60%乙酸后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min，用1cm比色杯(灵敏度低时可换2cm比色杯)，以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线。
低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为：吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0，2，4，6，8，10μg亚硝酸钠)。
5.2.2 样品测定：吸取10.0mL上述滤液(5.1)于25mL带塞比色管中，自5.2.1“于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液”起依法操作。同时做试剂空白。
6 计算
式中：X1——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg；
m1——样品质量，g；
m2——测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg；
V1——样品处理液总体积，mL；
V2——测定用样液体积，mL。
结果的表述：报告算术均值的二位有效数。
7 允许差
相对相差≤10%。
(二) 硝酸盐测定
8 原理
样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，或加入镉粉，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。
9 试剂
9.1 氯化铵缓冲溶液(pH9.6～9.7)：同3.1。
9.2 硫酸镉溶液(0.14mol/L)：称取37g硫酸镉(CdSO4·8H2O)，用水溶解，定容至1L。
9.3 盐酸溶液(0.1mol/L)：吸取8.4mL盐酸，用水稀释至1L。
9.4 硝酸钠标准溶液：准确称取500.0mg于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于500mL容量瓶中，加50mL氯化铵缓冲液，用水稀释至刻度，混匀，在4℃冰箱中避光保存。此溶液每毫升相当于1mg硝酸钠。
9.5 硝酸钠标准使用液：临用时吸取硝酸钠标准溶液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，临用时现配。此溶液每毫升相当于10μg硝酸钠。
9.6 亚硝酸钠标准使用液同3.8。
9.7 镉柱(镉粉)。
9.7.1 海绵状镉粉的制备：于500mL硫酸镉溶液中，投入足够的锌棒经3～4h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾斜法多次洗涤，然后移入粉碎机中，加500mL水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20～40目之间的部分，置试剂瓶中，用水封盖保存，备用。
9.7.2 镉柱还原效率的测定：取25mL酸式滴定管数支，向柱底压入1cm高的玻璃棉作垫，上置一小漏斗，将新配制的镉粉带水加入柱内，边装边轻轻敲击柱，排除柱内空气，加镉粉至8～10cm高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗。
当镉柱填装好后，先用25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25mL，调节柱流速至3～5mL/min。镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。
镉柱每次使用完毕后，应先以25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。
柱先加25mL氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，吸取2.0mL硝酸钠标准使用液(10μg/mL)，经柱还原，控制流速3～5mL/min，用50mL容量瓶接收。加入5mL氯化铵缓冲溶液，液面接近海绵镉时，加入15mL水洗柱，还原液和洗液一并流入50mL容量瓶中。加5mL60%乙酸，10mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，暗处放置25min。用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率(如镉柱还原率小于95%，应经盐酸浸泡活化处理)。
9.7.3 镉粉还原效率的测定：镉粉使用前，经盐酸浸泡活化处理，再以水洗两次，用水浸没待用。用牛角勺将镉粉加入25mL带塞刻度试管中，至5mL刻度；用少量水封住。吸取2.0mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氯化铵缓冲液。盖上试管塞，振摇2min，静止5min，用漏斗颈部塞有少量脱脂棉的小漏斗过滤，滤液定量收集于50mL容量瓶中，用15mL水少量多次地洗涤镉粉，洗液与滤液合并。加5mL乙酸(60%)后，立即加10mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，暗处置25min。用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于550nm波长处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率。
9.7.4 计算
式中：X2——还原效率，%；
20——硝酸盐的质量，μg；
m3——20μg硝酸盐还原后测得亚硝酸盐的质量，μg；
1.232——亚硝酸盐换算成硝酸盐的系数。
10 分析步骤
10.1 样品处理
同5.1。
10.2 测定(用镉柱法或镉粉法还原硝酸盐为亚硝酸盐)
10.2.1 甲法(镉柱法)：经活化的镉柱先加25mL氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，准确吸取5.1的样品滤液10.0mL，加入镉柱还原。以下按9.7.2自“控制流速3～5mL/min”起依法操作。
10.2.2 乙法(镉粉法)：准确吸取5.1的样品滤液10.0mL，置于盛有高度5mL镉粉的25mL带塞刻度试管中。自“加入5mL氯化铵缓冲液…”按9.7.3依法操作。
注：蔬菜、腌菜类食品中硝酸盐含量较高，可根据样品中硝酸盐的实际含量，将样品溶液稀释至适当浓度。
11 计算
式中：X3——样品中硝酸盐的含量，mg/kg；
m4——样品的质量，g；
m5——经镉粉还原后测得亚硝酸钠的质量，μg；
m6——直接测得亚硝酸盐的质量，μg； 1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数。
V3——样品处理液总体积，mL；
V4——测定用样液体积，mL。
结果的表述：报告算术平均值的两位有效数。
12 允许差
相对相差≤10%。
第二篇 示波极谱法(亚硝酸盐测定)(第二法)
13 原理
样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8－羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氮染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。
14 试剂
14.1 亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6·3H2O］，用水溶解，并稀释至1000mL。
14.2 乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌［Zn(CH3COO)2·2H2O］，加30mL冰乙酸溶于水，并稀释至1000mL。
14.3 饱和硼砂溶液：称取5.0g硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)，溶于100mL热水中，冷却后备用。
14.4 对氨基苯磺酸溶液(8g/L)：称取2g对氨基苯磺酸，用热水溶解，再加25mL盐酸(1.0mol/L)，移至250mL容量瓶稀释至刻度。
14.5 8－羟基喹啉溶液(1g/L)：称取0.250g8－羟基喹啉，加4mL盐酸(0.1mol/L)和少量水溶解，移至250mL容量瓶稀释至刻度。
14.6 EDTA溶液(0.10mol/L)：称取3.722gEDTA(C10H14N2O8Na·2H2O)，加水30mL溶解，转入100mL容量瓶中用水稀释至刻度。
14.7 氨水(5%)：吸取28%的浓氨水5.00mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
14.8 亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g亚硝酸钠于硅胶干燥器中24h，加水溶解移入500mL容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于200μg亚硝酸钠。
14.9 亚硝酸钠标准使用液：准确吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5μg亚硝酸钠。再取10.00mL该稀释液于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.5μg的亚硝酸钠。
15 仪器
15.1 小型绞肉机。
15.2 JP－2A或JP－1A示波极谱仪。
16 操作方法
16.1 样品处理
称取5.000g经绞碎混匀的样品(午餐肉，火腿肠可称10.00～20.00g)，置于50mL烧杯中，加12.5mL硼砂饱和液，搅拌均匀，以70℃的水300mL将样品洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min取出后冷却至室温，然后一面转动，一面加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液50mL，滤液备用。
16.2 测定
吸取3mL上述滤液于10mL容量瓶(或比色管)中，另取0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL亚硝酸钠标准溶液(相当于0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50μg亚硝酸钠)于10mL容量瓶(或比色管)中。于标准与样品管中分别加入0.20mLEDTA溶液(0.10m01/L)，1.50mL对氨基苯磺酸溶液(8g/L)，混匀，静止3～4min后各加入1.00mL8－羟基喹啉溶液(1g/L)和0.5mL氨水(5%)，用水稀释至刻度，混匀，静止10～15min，将试液全部转入电解池中(10mL小烧杯)。在示波极谱仪上采用三电极体系进行测定(滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极)。
测定参考条件：
原点电位调节在－0.2V；
倍率为0.1(可以根据试样中亚硝酸盐含量多少选择合适的倍率，含量高，倍率高，倍率选择在0.1以上；反之，倍率选择在0.1以下)；
电极开关拨至三电极、导数档；
测量开关拨至阴极。
将三电极插入电解池中，每隔7s仪器自行扫描一次，在荧光屏上记录－0.56V左右(允许电位波动10～20mV)的极谱波高，绘制标准曲线比较。
17 计算
式中：X4——样品中亚硝酸盐的含量，g/kg；
m8——测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg；
V5——样品溶液的总体积，mL；
V6——测定用样液的体积，mL；
m7——样品质量，g。
结果表述：报告算术平均值二位有效数。
18 允许差
相对相差≤10%。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准第一法由卫生部食品卫生监督检验所、河南省食品卫生监督检验所、吉林省卫生防疫站、青岛医学院负责起草；第二法由华中师范大学、湖北省食品卫生监督检验所、武汉同济医科大学负责起草。
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