第一篇 气相色谱－热能分析仪法(第一法)
1 主题内容与适用范围
标准规定了用气相色谱－热能分析仪(Gc－TEA)测定啤酒中挥发性N－亚硝胺的测定方法。
本标准适用于啤酒中N－亚硝基二甲胺含量的测定。
仪器的最低检出量为0.1ng，在样品取样量为50g，浓缩体积为0.5mL，进样体积为10μL时，本方法的最低检出浓度为0.1μg/kg；在取样量为20g，浓缩体积为1.0mL，进样体积为5μL时，本方法的最低检出浓度为1.0μg/Kg。
2 原理
样品中N－亚硝胺经硅藻土吸附或真空低温蒸馏，用二氯甲烷提取、分离，气相色谱－热能分析仪(GC－TEA)测定。其原理如下：
自气相色谱仪分离后的亚硝胺在热解室中经特异性催化裂解产生NO基团，后者与臭氧反应生成激发态NO＊。当激发态NO＊返回基态时发射出近红外区光线(600～2800nm)。产生的近红外区光线被光电倍增管检测(600～800nm)。由于特异性催化裂解与冷阱或CTR过滤器除去杂质，使热能分析仪仅仅能检测NO基团，而成为亚硝胺特异性检测器。
3 试剂
3.1 二氯甲烷：每批取100mL在水浴上用K－D浓缩器浓缩至1mL，在热能分析仪上无阳性响应。如有阳性响应，则需经全玻璃装置重蒸后再试，直至阴性。
3.2 氢氧化钠溶液(1mol/L)：称取40g氢氧化钠(NaOH)，用水溶解后定容至1L。
3.3 硅藻土：Extrelut(Merck)。
3.4 氮气。
3.5 盐酸(0.1mol/L)。
3.6 无水硫酸钠。
3.7 N－亚硝胺标准储备液(200mg/L)：吸取N－亚硝胺标准10μL(约相当于10mg)，置于已加入5mL无水乙醇并称重的50mL棕色容量瓶中，称量(准确到0.0001g)。用无水乙醇稀释定容，混匀。分别得到N－亚硝基二甲胺、N－亚硝基二丙胺、N－亚硝基吗啉的储备液。此溶液用安瓿密封分装后避光冷藏(－30℃)保存，两年有效。
3.8 N－亚硝胺标准工作液(200μg/L)：吸取上述N－亚硝胺标准储备液(3.7)100μL，置于10mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释定容，混匀。此溶液用安瓿密封分装后避光冷藏(4℃)保存，三个月有效。
4 仪器
4.1 气相色谱仪。
4.2 热能分析仪。
4.3 玻璃层析柱：带活塞，8mm内径，400mm长。
4.4 减压蒸馏装置。
4.5 K－D浓缩器。
4.6 恒温水浴锅。
5 分析步骤
5.1 提取
5.1.1 甲法：硅藻土吸附
称取20.00g预先脱二氧化碳气的样品于50mL烧杯中，加1mL氢氧化钠溶液(1mol/L)和1mLN－亚硝基二丙胺内标工作液(200μg/L)，混匀后备用。将12gExtrelut干法填于层析柱中，用手敲实。将啤酒样品装于柱顶。平衡10～15min后，用6×5mL二氯甲烷直接洗脱提取。
5.1.2 乙法：真空低温蒸馏
5.1.2.1 在双颈蒸馏瓶中加入50.00g预先脱二氧化碳气的样品和玻璃珠，4mL氢氧化钠溶液(1mol/L)，混匀后连接好蒸馏装置。在53.3kPa真空度低温蒸馏，待样品剩余10mL左右时，把真空度调节到93.3kPa，直至样品蒸至近干为止。
5.1.2.2 把蒸馏液移入250mL分液漏斗，加4mL盐酸(0.1mol/L)，用20mL二氯甲烷提取三次，每次3min，合并提取液。用10g无水硫酸钠脱水。
5.2 浓缩
将二氯甲烷提取液转移至K－D浓缩器中，于55℃水浴上浓缩至10mL，再以缓慢的氮气吹至0.4～1.0mL，备用。
5.3 样品测定
5.3.1 气相色谱条件
5.3.1.1 汽化室温度：220℃。
5.3.1.2 色谱柱温度：175℃，或从75℃以5℃/min速度升至175℃后维持。
5.3.1.3 色谱柱：内径2～3mm，长2～3m玻璃柱或不锈钢柱，内装涂以固定液①10%(m/m)聚乙二醇20M和氢氧化钾(10g/L)或②13%(m/m)Carbowax20M/TPA于载体Chromosorb WAW－DMCS(80～100目)。
5.3.1.4 载气：氩气，流速20～40mL/min。
5.3.2 热能分析仪条件
5.3.2.1 接口温度：250℃。
5.3.2.2 热解室温度：500℃。
5.3.2.3 真空度：133～266Pa。
5.3.2.4 冷阱：用液氮调至－150℃(可用CTR过滤器代替)。
5.3.3 测定
分别注入样品浓缩液和N－亚硝胺标准工作液5～10μL，利用保留时间定性，峰高或峰面积定量。
6 计算
式中：X1——样品中N－亚硝基二甲胺的含量，μg/kg；
h1——样品浓缩液中N－亚硝基二甲胺的峰高(mm)或峰面积；
h2——标准工作液中N－亚硝基二甲胺的峰高(mm)或峰面积；
c1——标准工作液中N－亚硝基二甲胺的浓度，μg/L；
V1——样品浓缩液的进样体积，μL；
V2——标准工作液的进样体积，μL；
V——样品浓缩液的浓缩体积，μL；
m1——样品的质量，g。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
7 允许差
相对相差＜16%。
第二篇 气相色谱－质谱仪法(第二法)
8 主题内容与适用范围
本标准规定了酒类、肉及肉制品、蔬菜、豆制品、茶叶等食品中N－亚硝基二甲胺、N－亚硝基二乙胺、N－亚硝基二丙胺及N－亚硝基吡咯烷含量的测定方法。
本标准适用于酒类、肉及肉制品、蔬菜、豆制品、调味品、茶叶等食品中N－亚硝基二甲胺、N－亚硝基二乙胺、N－亚硝基二丙胺及N－亚硝基吡咯烷含量的测定。
9 原理
样品中的N－亚硝胺类化合物经水蒸气蒸馏和有机溶剂萃取后，浓缩至一定量，采用气相色谱－质谱联用仪的高分辨峰匹配法进行确认和定量。
10 试剂
10.1 二氯甲烷：须用全玻璃蒸馏装置重蒸。
10.2 无水硫酸钠。
10.3 氯化钠：优级纯。
10.4 硫酸(1＋3)。
10.5 氢氧化钠溶液(120g/L)。
10.6 N－亚硝胺标准溶液：用二氯甲烷作溶剂，分别配制N－亚硝基二甲胺、N－亚硝基二乙胺、N－亚硝基二丙胺、N－亚硝基吡咯烷的标准溶液，使每毫升分别相当于0.5mgN－亚硝胺。
10.7 N－亚硝胺标准使用液：在四个10mL容量瓶中，加入适量二氯甲烷，用微量注射器各吸取100μLN－亚硝胺标准溶液，分别置于上述四个容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度。此溶液每毫升分别相当于5μgN－亚硝胺。
10.8 耐火砖颗粒：将耐火砖破碎，取直径为1～2mm的颗粒，分别用乙醇、二氯甲烷清洗后，在马弗炉中(400℃)灼烧1h，作助沸石使用。
11 仪器
11.1 水蒸气蒸馏装置：如图所示。
11.2 K－D浓缩器。
11.3 气相色谱－质谱联用仪。
12 分析步骤
12.1 水蒸气蒸馏
称取200g切碎(或绞碎、粉碎)后的样品，置于水蒸气蒸馏装置的蒸馏瓶中(液体样品直接量取200mL)，加入100mL水(液体样品不加水)，摇匀。在蒸馏瓶中加入120g氯化钠，充分摇动，使氯化钠溶解。将蒸馏瓶与水蒸气发生器及冷凝器连接好，并在锥形接收瓶中加入40mL二氯甲烷及少量冰块，收集400mL馏出液。
12.2 萃取纯化
在锥形接收瓶中加入80g氯化钠和3mL的硫酸(1＋3)，搅拌使氯化钠完全溶解。然后转移到500mL分液漏斗中，振荡5min，静止分层，将二氯甲烷层分至另一锥形瓶中，再用120mL二氯甲烷分三次提取水层，合并四次提取液，总体积为160mL。
对于含有较高浓度乙醇的样品，如蒸馏酒、配制酒等，须用50mL氢氧化钠溶液(120g/L)洗有机层两次，以除去乙醇的干扰。
12.3 浓缩
将有机层用10g无水硫酸钠脱水后，转移至K－D浓缩器中，加入一粒耐火砖颗粒，于50℃水浴上浓缩至1mL。备用。
12.4 气相色谱－质谱联用测定条件
12.4.1 色谱条件
12.4.1.1 汽化室温度：190℃。
12.4.1.2 色谱柱温度：对N－亚硝基二甲胺、N－亚硝基二乙胺、N－亚硝基二丙胺、N－亚硝基吡咯烷分别为130℃，145℃，130℃，160℃。
12.4.1.3 色谱柱：内径1.8～3.0mm，长2m的玻璃柱，内装涂以15%(m/m)PEG20M固定液和氢氧化钾溶液(10g/L)的80～100目Chromosorb W AW－DMCs。
12.4.1.4 载气：氦气，流速为40mL/min。
12.4.2 质谱仪条件
12.4.2.1 分辨率≥7000。
12.4.2.2 离子化电压：70V。
12.4.2.3 离子化电流：300μA。
12.4.2.4 离子源温度：180℃。
12.4.2.5 离子源真空度：1.33×10－4Pa。
12.4.2.6 界面温度：180℃。
12.4.3 测定采用电子轰击源高分辨峰匹配法，用全氟煤油(PFK)的碎片离子(它们的质荷比为68.99527，99.9936，130.9920，99.9936)分别监视N－亚硝基二甲胺、N－亚硝基二乙胺、N－亚硝基二丙胺及N－亚硝基吡咯烷的分子、离子(它们的质荷比为74.0480，102.0793，130.1106，100.0636)，结合它们的保留时间来定性，以示波器上该分子、离子的峰高来定量。
13 计算
式中：X2——样品中某一N－亚硝胺化合物的含量，μg/kg或μg/L；
h3——浓缩液中该N－亚硝胺化合物的峰高，mm；
h4——标准使用液中该N－亚硝胺化合物的峰高，mm；
c2——标准使用液中该N－亚硝胺化合物的浓度，μg/mL；
V3——样品浓缩液的体积，mL；
m2——样品质量(体积)，g(mL)。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准第一法由北京医科大学公共卫生学院、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草；第二法由吉林省卫生防疫站负责起草。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
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