动物试验
1 实验动物
选用小鼠。推荐使用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，6－8周龄，18－22g，雌雄均可，数量为单一性别每组至少10只。
2 给受试物的时间、剂量分组
经口给予受试物15－30d，设3个剂量组和1个对照组。3个剂量组中，其中1个剂量应相当于人推荐摄入量的10倍左右。
3 实验方法
3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
可任选下列方法之一
3.1.1 MTT法
3.1.1.1 原理
当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲(formazan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。
3.1.1.2 仪器和材料
RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2－巯基乙醇(2－ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液(pH7.2－7.4)
200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、酶联免疫检测仪、超净工作台
3.1.1.3 实验步骤
3.1.1.3.1 试剂配制
完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺(200mmo1/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100ug/L)及5×10－5mol/L的2－巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH调pH至7.0－7.2，即完全培养液。
ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(－20℃)保存。
无菌Hanks液 用前以3.5%的无菌NaHC03调pH7.2－7.4。
MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。
酸性异丙醇溶液 96mL异丙醇中加入4mL lmol/L的HCl，临用前配制。
3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，调整细胞浓度为2×106个/mL。
3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应
将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔lmL，一孔加50ul ConA液(相当于5ug/mL)，另一孔作为对照，置5%CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50ul/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1mL比色杯中，在721分光光度计上比色测定，波长570nm。
3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。
3.1.2 同位素掺入法
3.1.2.1 原理
淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H－胸腺嘧啶核苷(3H－TdR)，则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。
3.1.2.2 仪器和材料
RPMI－1640细胞培养液、小牛血清、2－巯基乙醇(2－ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、Hanks液、PBS缓冲液(pH7.2－7.4)、3H－TdR、闪烁液〔2，5－二苯基恶唑(PP0)0.5g、1，4－双－(5－苯基恶唑基)－苯(POPOP)0.25g、二甲苯500mL混匀〕200目筛网，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。
3.1.2.3 实验步骤
3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×106个/mL。
3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应： 将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5%CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H－TdR20ul，使其终浓度为(3.7－18.5)×104Bq/mL。用多头细胞取集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。
3.1.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。以每分钟脉冲数(cpm)表示增殖程度，用刺激指数(SI)来表示
受试物组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项试验结果阳性。
3.2 迟发型变态反应(DTH)
可任选下列方法之一
3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)
3.2.1.1 原理
二硝基氟苯(DNFB)是一种半抗原，将其稀释液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7d后再将其涂抹于耳部，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24～48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。
3.2.1.2 材料
DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。
3.2.1.3 实验步骤
⒊2.1.3.1 试剂配制 DNFB溶液 DNFB溶液 应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液(丙酮：麻油＝1∶1)，倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250ul注射器通过瓶盖取用。
3.2.1.3.2 致敏 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50ul均匀涂抹致敏。
3.2.1.3.3 DTH的产生与测定5d后，用DNFB溶液10ul均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。
3.2.1.4 数据处理与结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。左右耳重量之差表示DTH的程度。受试物组的差值显著高于与对照组的差值，即可判定该项试验结果阳性。
3.2.1.5 注意事项
操作时应避免DNFB与皮肤接触。
3.2.2 绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法)
3.2.2.1 原理
SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4d后，当再以SRBC攻击时，即可见攻击部位出现迟发型变态反应。
3.2.2.2 材料
游标卡尺(精密度0.02mm)、SRBC、微量注射器(50μL)。
3.2.2.3 实验步骤
3.2.2.3.1 致敏 小鼠用2%(v/v)SRBC腹腔或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL(约1×108个SRBC)。
3.2.2.3.2 DTH的产生与测定免疫后4d，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC，每只鼠20ul(约1×108个SRBC)，注射后于24h、48h分别测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。
3.2.2.4 数据处理和结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试物组的差值显著高于对照组的差值，即可判定该项试验结果阳性。
3.2.2.5 注意事项
测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。
攻击时所用的SRBC要新鲜(保存期不超过1周)。
3.3 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
3.3.1 原理
用绵羊红细胞(SRBC)免疫过的小鼠脾脏，制成细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体可反映抗体分泌细胞数。
3.3.2 仪器和材料
二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SBC、补体(豚鼠血清)、Hanks液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。
3.3.3 实验步骤
3.3.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
3.3.3.2 制备补体 采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，使用前将lmL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装小瓶，－70℃保存。用时以SA液按1∶10稀释。
3.3.3.3 玻片涂膜 在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL，加热溶解)，待干后放片盒可长期保存备用。
3.3.3.4 免疫动物 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×107～2×108个。也可将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL。
3.3.3.5 脾细胞悬液制备
将SRBC免疫4～5d后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hanks液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000/min)10min，用Hanks液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5x106个/mL。
3.3.3.6 空斑的测定
将表层培养基(l琼脂加双蒸水至100mL)加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50ul 10%SRBC(v/v，用SA液配制)，20ul脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1～1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶10)加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。
3.3.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计，用空斑数/106脾细胞来表示。
受试物组的空斑数显著高于对照组的空斑数，即可判定该项试验结果阳性。
3.4 血清溶血素的测定
可任选下列方法之一。
3.4.1 血凝法
3.4.1.1 原理
用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体(溶血素)，利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。
3.4.1.2 仪器和材料
SRBC、生理盐水、微量血凝试验板、离心机
3.4.1.3 实验步骤
3.4.1.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
3.4.1.3.3 凝集反应用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝试验板内，每孔100ul，再加入100ul 0.5%(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
3.4.1.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计，血清凝集程度一般分为5级(0－IV)记录，按下式计算抗体积数，受试物组的抗体积数显著高于对照组的抗体积数，即可判定该项试验结果阳性。
抗体积数＝(S1＋2S2＋3S3……nSn)
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。
I级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。
Ⅱ级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
Ⅲ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。
Ⅳ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
3.4.1.5 注意事项
血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。
3.4.2 半数溶血值(HC50)的测定
3.4.2.1 原理
用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体(溶血素)，与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量.
3.4.2.2 仪器和材料
721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、都式试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL)
3.4.2.3 实验步骤
3.4.2.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
3.4.2.3.2 制备补体 采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，使用前将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装小瓶，－70℃保存。用时以SA液按1∶10稀释。
3.4.2.3.3 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
3.4.2.3.4 溶血反应 取血清用SA缓冲液稀释(一般为200～500倍)。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA液按1：10稀释)，另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37℃恒温水浴中保温15～30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，都氏试剂3mL于试管内，同时取10%(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，于另一支试管内，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
3.4.2.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计，溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下列公式计算，受试物组的HC50显著高于对照组的HC50，即可判定该项试验结果阳性。
3.5 小鼠碳廓清试验
3.5.1 原理
在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系，即吞噬速度与血碳浓度成正比，而与已吞噬的碳粒量成反比。
以血碳浓度对数值为纵座标，时间为横座标，两者呈直线关系。此直线斜率(K)可表示吞噬速率，亦可称为未经校正的吞噬指数。因动物肝、脾重量不等，故K值亦不同。为此，一般以校正的吞噬指数a表示。a反映了每单位组织重量的吞噬活性，公式如下：
3.5.2 仪器和试剂
721分光光度计、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3
3.5.3 实验步骤
3.5.3.1 溶液配制 注射用墨汁将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。
Na2CO3溶液 取0.1gNa2CO3，加蒸馏水至100mL。
3.5.3.2 注射墨汁小鼠尾静脉注稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1mL计算。待墨汁注入立即计时。
3.5.3.3 测定
注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20ul，并将其加到2mL Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。
将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，
3.5.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计，以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a.受试物组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，即可判定该项试验结果阳性。
3.5.5 注意事项
静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。
墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。
使用新的墨汁时，应在试验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在20～30min内不易廓清，而激活的小鼠可明显廓清。
3.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)
3.6.1 原理
巨噬细胞能吞噬鸡红细胞。将上述2种细胞温育后染色，在油镜下计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分比，并观察细胞内鸡红细胞的形态。据此判断巨噬细胞的吞噬功能和消化功能。
3.6.2 仪器和材料
显微镜、鸡红细胞、丙酮、甲醇、生理盐水、Giemsa染液。
3.6.3 实验步骤
3.6.3.1 鸡红细胞悬液制备取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤2～3次，离心(2000r/min，10min)，去上清，用生理盐水配成20%(v/v)的鸡红细胞悬液。
3.6.3.2 吞噬功能测定每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1mL。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4%(v/v)Giemsa－磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。
3.6.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计，以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数受试物组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较，差异有显著性，即可判定该项试验结果阳性。
在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能，通常分为4级：
Ⅰ级 未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫色。
Ⅱ级 轻度消化。胞质浅黄绿色、胞核固缩呈紫蓝色。
Ⅲ级：重度消化。胞质谈染，胞核谈浅灰色。
Ⅳ级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见. 3.7 NK细胞活性测定
可任选下列方法之一
3.7.1 乳酸脱氢酶(LDH)测定法
3.7.1.1 原理
活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，INT接受H+被还原成紫红色甲类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。
3.7.1.2 仪器和材料
酶标仪、YAC－1细胞、Hanks液(pH7.2～7.4)、RPMI1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、0.2mol/L的Tris－HC1缓冲液(pH8.2)、1% NP40
3.7.1.3 实验步骤
3.7.1.3.1 LDH基质液的配制
乳酸锂5×10－2mol/L
硝基氯化四氮唑(INT)6.6×10－4mol/L
吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)2.8×10－4mol/L
氧化型辅酶I(NAD)1.3×10－3mol/L
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris－HCI缓冲液中(pH8.2)
3.7.1.3.2 靶细胞的传代(YAC－1细胞)
试验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×105个/mL。
3.7.1.3.3 脾细胞悬液的制备(效应细胞)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，最后用RPMI140完全培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。
3.7.1.3.4 NK细胞活性检测
取靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100ul；上述各项均设三个复孔，于37℃、5% CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100ul置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100ul，反应3min，每孔加入1mol/L的HC130ul，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
3.7.1.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计，按下式计算NK细胞活性，受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项试验结果阳性。
3.7.1.5 注意事项
靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95%
比色时环境温度应保持恒定
LDH基质液应临用前配制
在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。
3.7.2 同位素3H－TdR测定法
3.7.2.1 原理
将用同位素3H－TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞3H－TdR的释放率即可反应NK细胞的活性。
3.7.2.2 仪器和材料
液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、3H－TdR、RPMI1640完全培养液、Hanks液(pH7.2～7.4)、YAC－1细胞、Triton X－100
3.7.2.3 实验步骤
3.7.2.3.1 靶细胞的标记
取传代后24h生长良好的YAC－1细胞(存活率＞95%)按1×106/mL YAC－1细胞悬液加3H－TdR 10uCi进行标记，于37℃、5% CO2培养箱中培养2h，每30min振荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1×105个/mL。
3.7.2.3.2 脾细胞悬液的制备(效应细胞)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×107个/mL。
3.7.2.3.3 NK细胞活性测定
在96孔培养板中每孔加100ul标记的靶细胞，试验孔加100ul效应细胞，空白对照孔加100ul培养液，最大释放孔加100ul 2.5%Triton X－100。每个样品设3个复孔，置5%CO2、37℃培养箱内温育4h，用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。
3.7.2.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计。按下式计算NK细胞活性，受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项试验结果阳性。
人体试食试验
1 人外周血淋巴细胞转化试验(MTT法)
1.1 原理
当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。
1.2 仪器和材料
肝素、淋巴细胞分离液、PHA、RPMI1640培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、盐酸、异丙醇、MTT、Hanks液、二氧化碳培养箱、酶联免疫检测仪。
1.3 实验步骤
1.3.1 淋巴细胞的分离
取肝素抗凝血加等量Hanks液稀释，混匀。于试管内先加入2～2.5mL淋巴细胞分离液，用毛细吸管吸取上述已稀释的血液沿管壁轻轻叠加到分离液上方，形成清皙界面。置水平式离心机上，2500r/min离心10min，即可出现分层。用毛细滴管沿管壁伸入乳白色细胞层中，将此层细胞悬液吸出，用Hanks液洗涤3次(2000r/min，10min)。最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×106个/mL。
1.3.2 淋巴细胞增殖反应
将淋巴细胞悬液分两孔加入到24孔培养板中，每孔1mL，一孔加PHA 10ug，另一孔作为对照。置5% CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50u1/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作为平行样，以570nm波长测定光密度值。
1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。以光密度值代表淋巴细胞增殖能力。受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。
2 单向免疫扩散法测定IgG、IgA、IgM
2.1 原理
将抗Ig血清均匀地分散于琼脂内，待凝固后于其上打孔，再将抗原(相应的Ig)加入孔中，使其向四周扩散，抗原抗体复合物形成的沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。
2.2 材料
测量尺、商品化的单向免疫扩散板
2.3 实验步骤
静脉取血，分离血清。将血清加入免疫扩散板的孔内，观察扩散情况，测量沉淀环的直径，从标准曲线中求出IgG、IgA、IgM的量。
2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。受试物组的Ig量显著高于对照组的Ig量，即可判定该项试验结果阳性。
3 吞噬与杀菌试验(白色念珠菌法)
3.1 原理
白细胞与白色念珠菌共育后加入美蓝染液作活体染色，可观察白细胞对白色念珠菌的吞噬情况。正常情况下，活菌对染料发生排斥，如白色念珠菌被染成蓝色，说明已被吞噬细胞吞噬并杀死。
3.2 仪器和材料
显微镜、肝素、右旋糖酐、RPMI1640培养液、美蓝
3.3 实验步骤
3.3.1 白细胞悬液 肝素抗凝血加等容积60g/L右旋糖酐或30g/L明胶，充分混匀后静置20～30min，吸取血浆层，1000r/min离心10min，弃上清。用8.3g/L NH4Cl低渗溶液破坏残留的红细胞，离心弃上清。用含10%新鲜人AB型混合血清的RPMI1640培养液配成每油镜视野3－4个细胞。
3.3.2 白色念珠菌液 自沙氏斜面培养基上挑取新生长的白色念球菌菌落半个，于0.5mL生理盐水中混悬，配成约6×106/mL浓度。
3.3.3 美蓝染液 取美蓝20mg溶于10g/L碳酸钠水溶液中，滤纸过滤后使用。
3.3.4 吞噬杀菌功能检测 取白细胞悬液0.5mL，加白色念珠菌液0.5mL，充分混匀后将试管加塞，37℃温育45min。取出后2000r/min离心10min，弃上清，(保留少许)，混匀沉淀后，取沉淀1滴置玻片上，加美蓝染液1滴混匀，复以盖玻片。5min后油镜检查白细胞内吞噬的白色念珠菌。淡蓝色为死菌，未着色者为活菌。
3.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。按下式计算吞噬率和杀菌率。受试物组吞噬率显著高于杀菌率与对照组的吞噬率和杀菌率，即可判定该项试验结果阳性。
4 服细胞活性测定
4.1 原理
将用同位素51Cr标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤，同位素便从被破坏的靶细胞中释放出来，测定51Cr的释放量即可了解到NK细胞的活性。
4.2 仪器和材料
γ计数仪、二氧化碳培养箱、Na251CrO、RPMI1640完全培养液、Hanks液(pH7.2～7.4)、K562细胞、SDS
4.3 实验步骤
4.3.1 淋巴细胞的分离(效应细胞)
取肝素抗凝血加等量Hanks液稀释，混匀。于试管内先加入2～2.5mL淋巴细胞分离液，用毛细吸管吸取上述已稀释的血液沿管壁轻轻叠加到分离液上方，形成清哲界面。置水平式离心机上，2500r/min离心10min，即可出现分层。用毛细滴管沿管壁伸入乳白色细胞层中，将此层细胞悬液吸出，用Hanks液洗涤3次(2000r/min，10min)。最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。
4.3.2 标记靶细胞 以K562细胞株作为靶细胞。取传代的K562细胞4×106个/0.5mL，加100uCiNa251CrO4，5% CO2、37℃培养1.5h，时时摇动，离心弃上清。用培养液洗3次，调整其细胞浓度为1×105个/mL。
4.3.3 NK细胞活性测定
试验管：效应细胞和标记靶细胞各0.2mL，效靶比为50∶1。
自然释放管：完全培养液0.2mL，标记靶细胞0.2mL。
最大释放管：标记靶细胞0.2mL，20g/L SDS0.2mL。
以上各管分别设3个复管，5%CO2、37℃培养4h后，各管分别加入冷的Hanks液0.6mL，2500×g离心5min，各取0.5mL上清液，用γ计数仪测各管的cpm。
4.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。按下式计算NK细胞活性。受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项试验结果阳性。 |
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