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葡萄成熟时，在果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，它们依靠葡萄分泌物生存，不同的酵母菌之间相互作用构成了一个平衡体系。葡萄破碎后酵母进入葡萄汁液中，在适当的温度下，这些酵母菌将大量繁殖破坏原有的微生物平衡，这种条件下产生的发酵方式一般称之为自然发酵。
在葡萄酒自然发酵过程中，不同的酵母发挥作用的时间不同，在发酵的初始阶段由酒精耐受能力较低的非酿酒酵母来完成，如假丝酵母、克鲁维酵母和汉森酵母等。研究表明，非酿酒酵母的生长有助于酒风味的形成，特别是甘油、酯类和高级醇等物质的产生对酒风味的形成具有积极的作用，但发酵1天—3天后非酿酒酵母逐渐被酒精耐受能力较高的酿酒酵母所取代。一般认为，酿酒酵母和非酿酒酵母的这种交替关系是由于菌种之间对外界环境的抵抗能力的差异造成的，比如酒精浓度的升高、有机酸的积累，pH的不断降低以及营养物质的消耗等，都可能造成非酿酒酵母的衰亡。
一些研究表明，酵母在发酵规程中产生的一些代谢产物会抑制其它菌的生长，如中长链脂肪酸以及糖蛋白、多肽等，小分子量的信号分子等。也有一些研究表明酿酒酵母与非酿酒酵母间的交替作用并不是由于一些有毒物质代谢产物的分泌而产生的，而是由于在高细胞浓度下细胞间为争夺生存空间造成的。非酿酒酵母存活时间的长短对葡萄酒风味物质的形成有着很大的影响。因此，找出酵母这种交替关系的形成机制成为葡萄酒酿造中一个急需解决的问题。
本实验选择葡萄皮表面一种常见的非酿酒酵母——克鲁维酵母作为出发菌株，通过透析袋式发酵法，采用单因素实验、发酵上清抑菌实验以及双向电泳等分析方法，考察外界环境变化对克鲁维酵母生长的影响，探讨克鲁维酵母衰亡的原因。
1材料与方法
1.1材料 酿酒酵母，克鲁维酵母，均由大连工业大学菌种保藏中心提供。培养基采用全合成培养基，pH3.3，葡萄糖200g，柠檬酸6 g，DL—苹果酸6 g，KH2PO4 750mg，K2SO4 500mg，MgSO4·7H2O 250 mg，CaCl2·2H2O 155mg，NaCl200mg，MnSO4·H2O 4mg ZnSO4 4mg，CuSO4·5H2O 1mg，KI 1mg, CaCl2·6H2O 400ug，H3BO3 1mg，（NH4）6Mo7O24·2H2O 1mg，NH4Cl300mg YNB 3.3g，经110℃、20min杀菌。
1.2 方法
1.2.1 克鲁维酵母生长曲线的测定方法
克鲁维酵母生长变化情况通过平板计数法测定：直接将菌适当稀释后涂布于YPDA培养基中（5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g葡萄糖、琼脂粉20g pH5.6），28℃培养3天，计数。
1.2.2 残糖的测定方法
发酵液中残糖的测定采用3，5—二硝基水杨酸法
1.2.3 酒精浓度的测定
发酵第4天酒精浓度的测定采用试剂盒法
1.2.4 发酵方法
酿酒酵母和克鲁维酵母纯培养：直接将种子液接种到预先准备好的SM培养基中，接种浓度1×104CFU/ml。
透析袋发酵：采用截留分子量为10kDa的透析袋，将克鲁维酵母接种于透析袋内，将酿酒酵母接种于透析袋外侧，接种的浓度均为1×104CFU/ml。透析袋经110℃、20min 杀菌，每6天更换1次。
1.2.5 诱导因素的单因素实验
酒精、pH对衰亡诱导作用的确定方法：取新鲜的SM培养基，调节酒精度至43g/l，PH23（透析发酵第4天时的酒精浓度及pH），接入克鲁维酵母，接种浓度为1×104CFU/ml，28℃下静置培养，观察其生长的变化。
上清液对克鲁维酵母衰亡的诱导作用：取发酵4天的透析袋外侧发酵液，经10000r/min，10min离心取上清液，然后接入克鲁维酵母，接种浓度为1×104CFU/ml，观察生长状态的变化。
氮源对克鲁维酵母衰亡的诱导作用：取透析袋发酵（发酵4天的透析袋外侧）发酵液，经10000r/min，10min离心取上清液，然后加入与新鲜培养基相同浓度的氮源，接入克鲁维酵母，接种浓度为1×104CFU/ml，观察其生长的变化。
酿酒酵母胞外分泌蛋白对克鲁维酵母衰亡的诱导实验：分别取发酵4天的酿酒酵母纯培养和透析袋发酵（透析袋外侧）发酵液，经10000r/min，10min离心取上清液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩约10倍，然后冷冻干燥成粉末，将粉末紫外杀菌后溶于无菌水中制成蛋白溶解液，最后将该蛋白质溶解液分别加入到发酵4天的发酵上清液（透析袋外侧）中，接入克鲁维酵母，接种浓度为1×104CFU/ml，并观察生产状态的变化。
1.2.6 双向电泳
将上述蛋白质干粉分别溶解于样品缓冲液中，室温下裂解1小时。将裂10000r/min 离心10min，取上清。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。双向电泳采用O'FARRELL（1975）的方法。
1.2.7 凝胶图像的分析
使用Pdquest 8.0软件对凝胶图像进行分析。
2结果
2.1 外界条件对非酿酒酵母生长的影响
为确定外界环境变化对克鲁维酵母衰亡的影响，本实验采用单因素实验的方法研究各个因素在克鲁维酵母衰亡中的作用，结果如图1。由图1可看出，增加培养基中的酒精浓度、改变培养基PH对克鲁维酵母生长的影响比较小。
酒精（43g/L）的升高、pH（23）的改变并非诱导克鲁维酵母衰亡的主要因素。与上述的2种发酵条件不同，为验证营养物质、溶氧在克鲁维酵母衰亡中的作用，实验堆第4天透析袋外侧发酵液的抑菌活力进行研究。
在发酵上清液中接入克鲁维酵母，菌体经短暂休整后开始衰亡，培养8天后完全消失。在好氧培养时对克鲁维酵母能够存活10天，表明溶氧的增加有一定的缓解作用，但并没有从根本上解除上清液对菌体衰亡的诱导作用，说明溶解氧不是克鲁维酵母衰亡的主要因素。同样，上清液中氮源浓度的改变在克鲁维酵母的衰亡中作用也较小。
2.2 不同发酵条件下生长曲线
为确定生存空间对克鲁维酵母的影响，本实验采用透析袋发酵法对克鲁维酵母生长变化进行研究。由图2可见，克鲁维酵母的生长在2种发酵条件下发生了巨大变化。透析袋发掘中克鲁维酵母的生长速度明显低于纯培养时的生长速度。
而且在透析袋发酵中克鲁维酵母的最高菌体数低于纯培养，5天后，克鲁维酵母菌体浓度由1×107CFU/ml下降到5×103CFU/ml。在透析袋发酵中克鲁维酵母不经稳定期而直接进入衰亡期，而且进入衰亡期后细胞的衰亡速度较快，说明克鲁维酵母并非自然衰亡，并非生存空间的争夺引起死亡，而是外界因素的改变诱导了细胞的衰亡。
2.3发酵上清液胞外蛋白解析
综上，可判明克鲁维酵母的衰亡是由于酿酒酵母分泌的代谢产物引起的，因此，本研究采用双向电泳法对酿酒酵母胞外分泌蛋白进行了研究，确定分泌蛋白对克鲁维酵母衰亡的影响。
由胞外蛋白图谱可见，蛋白质斑点较模糊，这主要是因为胞外分泌的蛋白质一般都经过了糖基化、磷酸化等修饰，这种修饰对后续染色产生了影响。
但酿酒酵母在纯培养和透析袋培养中胞外蛋白的分泌总体上是一致的，蛋白大都分布在pH为3—5内，但透析袋发酵下酿酒酵母产生了一些特异蛋白，为了验证这些特异蛋白的抑菌活力，本实验对透析袋培养和纯培养上清液中大于10kDa的分泌蛋白进行浓缩并添加入第4天的发酵上清液中进行抑菌实验。
在添加酿酒酵母胞外蛋白浓缩物后克鲁维酵母的衰亡速度明显加快，且透析袋发酵所产生分泌蛋白的诱导性更强。证明酿酒酵母在纯培养的过程中分泌的一些分子量大于10kDa的蛋白质对克鲁维酵母的衰亡产生诱导作用，且透析袋发酵中克鲁维酵母的存在会诱导酿酒酵母分泌一些特异性蛋白质，这些特异蛋白类混合物对克鲁维酵母的衰亡具有较强的诱导作用。
3讨论
本实验采用透析袋发酵法，通过单因素实验、发酵上清液抑菌实验以及双向电泳等分析方法研究混菌发酵中克鲁维酵母衰亡的原因。
结果表明，溶氧量、pH、酒精度、营养物质以及生存空间的争夺并不是其衰亡的原因，酿酒酵母在纯培养的过程中分泌的一些分子量大于10kDa的蛋白类物质会对克鲁维酵母的衰亡产生诱导作用。而且克鲁维酵母的存在会诱导酿酒酵母分泌一些特异性蛋白类物质，这些特异蛋白类物质对克鲁维酵母的死亡形成诱导作用。
采用截留分子量为10kDa透析膜发酵，克鲁维酵母同样出现提前死亡的情况，说明酿酒酵母分泌的分子量较小的代谢产物对克鲁维酵母的衰亡也具有诱导作用。综合上述，酿酒酵母分泌的分子量小于10kDa的代谢产物和一些分子量超过10kDa的蛋白类物质均对克鲁维酵母等酿酒酵母的衰亡等具有诱导作用。
酿酒酵母分泌蛋白在克鲁维酵母的衰亡中起到重要作用，在后续的研究中可以对一些特异性蛋白进行分离，结合MALD—TOF/MS等技术对蛋白进行解析，找到克鲁维酵母细胞内代谢的途径变化，通过克鲁维酵母在葡萄酒发酵过程中细胞代谢途径的变化，解释葡萄酒发酵过程中酵母之间交替关系形成的机制，最终为提高葡萄酒的风味提供理论基础。
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