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1 生存试验
1.1 原理：利用生物的整个生存过程来观察营养、受试物、环境等外界因素对其寿命的影响。
1.2 基本要求
1.2.1 所选择的实验动物要具有试验周期短，饲养管理简便，重复性好等优点。
1.2.2 实验动物保持原有的正常生存条件。不能片面地追求缩短时间，否则生长发育不正常，难以得出可靠结果。
1.2.3 在整个生存试验中必须统计动物进食量。受试物组的进食量不能低于对照组，尽量使各组进食量保持一致。限制体重能延长一些动物的寿命，这一现象称为Mecay效应，生存试验中忽视这一效应往往影响结果的判断。
1.2.4 实验环境的温度必须保持在一定范围内(24－26℃)。变温动物(果蝇)随温度降低寿命延长，而恒温动物(大、小鼠)寿命则缩短，忽视温度的变化，影响结果的判断。
1.2.5 为缩短实验周期，可选用老年动物，或根据25%、50%动物死亡时间来估计实验结果(一般要求样本数大)。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠生存试验
1.3.1.1 实验动物
小鼠属于啮齿目(Rodentia)鼠科(Muridae)小鼠属动物，寿命2－3年，食性、代谢过程以及生长发育、繁殖、衰老阶段均与人类相似，而且体型小、性情温顺、饲料消耗少、易于饲养管理、对多种病原体容易感染，实验的准确性和重复性好。选用12月龄小鼠，每组40只，雌雄各半。
1.3.1.2 剂量分组 随机分成1个对照组和3个剂量组，人每公斤体重日推荐摄入量10倍，作为其中1个剂量，另2个剂量根据受试物的具体情况，在这个剂量基础上，上下浮动。
1.3.1.3 小鼠饲料 麦粉18%、面粉18%、黄豆粉18%、玉米粉18%、米粉18%、鱼粉8%、骨粉1%、酵母粉1%。
1.3.1.4 实验步骤
取160只小鼠，饲养在25℃的室温和50－70%相对湿度下，自然采光，经常通风换气，喂以常规饲料。一般采用灌胃法、掺入饲料法或加入饮水法给予受试物，从12月龄开始给予，直至死亡。然后每天统计其死亡鼠数，直至全部自然死亡。比较受试物组与对照组的平均寿命和最高寿命，画出其生存曲线图，统计半数动物死亡天数。
1.3.1.5 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理，并按动物性别分别统计。受试物组与对照组比较，寿命延长经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物小鼠生存试验阳性。
1.3.2 大鼠生存试验
1.3.2.1 实验动物
大鼠(Rattus norvegicus)属于啮齿目(Rodentia)鼠科(Muridae)大鼠属动物，寿命2.5－3年，食性、代谢过程以及生长发育、繁殖、衰老阶段均与人类相近，具有繁殖快、抗病力强、容易饲养、便于管理等特点。选用18月龄大鼠。每组30只，雌雄各半。
1.3.2.2 剂量分组
随机分成1个对照组和3个剂量组，人每公斤体重日推荐摄入量5倍，作为其中1个剂量，另2个剂量根据受试物的具体情况，在这个剂量基础上，上下浮动。
1.3.2.3 大鼠饲料小米粉20%、机米粉24%、麦麸5%、鱼粉8%、黄豆粉5.5%、蛋黄粉3%、绿豆粉5%、酵母粉2%、小米0.5%、鱼肝油2%、麻油3%、骨粉1%、食盐1%。
1.3.2.4 实验步骤
取120只大鼠，饲养在21±1℃的室温和50－70%相对湿度下，自然采光，配有通风设备，动物笼子用金属的。要防止其食粪习性影响实验结果，一般采用灌胃法、掺入饲料法、加入饮水法给予受试物，从18月龄开始给予，直至死亡。每天观察并记录其死亡数，直至全部自然死亡。比较受试物组与对照组的平均寿命和最高寿命，画出其生存曲线图，统计半数动物死亡天数。
1.3.2.5 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理，并按动物性别分别统计。受试物组与对照组比较，寿命延长经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物大鼠生存试验阳性。
1.3.3 果蝇生存试验
1.3.3.1 实验动物
果蝇是双翅目果蝇属昆虫，约900多种，通常选用黑腹果蝇(drosophila mela－nogaster)。其许多代谢途径、生理学功能和发育分段同哺乳动物基本相似，具有与人类相似的生长发育、繁殖和衰老阶段。
果蝇整个生命周期包括卵－幼虫－蛹－成虫4个阶段。25℃时从卵到成虫为10.2d，成虫寿命雄性为53.5d、雌性为60.1d，果蝇性别区分幼虫期较难，成虫区分见下表。（略）
＊性梳指第一对脚的跗节前端表面的黑色鬃毛流苏，用此标志区分性别更为准确。
1.3.3.2 试剂和仪器：
暗温箱(20－25℃、湿度60－65%)、培养指管(平底)1.3×10cm或3×13cm、乙醚、苯甲酸。
1.3.3.3 果蝇基础饲料及配制方法(以100g饲料为例)
玉米粉10%、红糖13.5%、琼脂1.5%、苯甲酸0.15%、干酵母粉1%、水73.85%，白然pH
1.3.3.3.1 将10g玉米粉倒入250mL烧杯中，加自来水36mL，在电炉上加热调成糊状。
1.3.3.3.2 将琼脂1.5g放入100mL烧杯中，加自来水40mL，在电炉上煮沸使充分溶解，加红糖13.5g、苯甲酸0.15g(用3mL 95%乙醇溶解)或丙酸1mL，煮沸溶解。
1.3.3.3.3 将上述两者混合，煮沸，称重。如饲料重量不足99g，则补加100℃热水至总重99g。立即加入干酵母粉1.0g，充分调匀。
1.3.3.4 受试物处理
受试物加入饲料之前，必须用水或其它有机溶剂溶解。不易溶解的物质，必须用乳钵研磨成粉末，越细越好，将粉末加入溶化的饲料中，充分调匀，也可先称重，然后加15倍水在室温下浸泡4h，再在100℃水浴锅中处理1h，用定量滤纸抽滤，滤液浓缩到一定程度后，按需要分别加入基础饲料中。试验样品加入前后，必须注意饲料pH变化，一般情况下应使各组pH值保持一致。
1.3.3.5 剂量分组设1个空白对照组和3个剂量组，各剂量组饲料含受试物浓度分别为0.2%、1%、5%。
1.3.3.6 实验步骤
卵、幼虫、蛹及成虫均培养在25℃±1℃，65%相对湿度的暗温箱中。将常用基础饲料煮成粥后分装于无菌培养指管(3.0cm×13cm)中，每支培养管内基础饲料厚度为0.5～1.0cm，用双层无菌白棉布封口，成虫基础饲料每4更换1次，将培养管平放在恒温箱内饲养。收集10h内孵出的成虫进行分组，在此时间范围内孵化的果蝇均未交配。把蘸有乙醚的脱脂棉球放入带有内径1mm针头的10mL注射器内，来回抽动，将乙醚蒸气用注射器打入盛有果蝇的指管中，严防液态乙醚打入，待果蝇完全麻醉后倒出称重分组，选择个体大小相近的果蝇，每管25只，雌雄分养，每组雌雄果蝇各100只，在成虫期给受试物，受试物掺入基础饲料中，并保持各组pH值一致。每天定时3次统计果蝇存活数、死亡数，直到全部死亡。每组最后死亡的10只果蝇成虫存活天数的平均数为该组的最高寿命。试验结束，计算平均寿命和最高寿命以及半数死亡时间。
结果观察（略）
1.3.3.7 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理，并按动物性别分别统计。受试物组与对照组比较，寿命延长经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物果蝇生存试验阳性。
1.3.3.8 注意事项
1.3.3.8.1 新羽化的成虫，个体越大，平均寿命与最高寿命越长。因此分组时要尽量选择大小均一的样本。
1.3.3.8.2 培养管在使用前一定要烤干。
1.3.3.8.3 培养管一定要平放，采用透气材料封口，要及时清除死蝇。
1.3.3.8.4 为避免感染杂菌，培养容器要消毒，无菌操作，培养环境定期用杀菌剂处理，夏天使用的饲料，苯甲酸含量提高到0.4%，也可在饲料中加入抗菌素。
2 过氧化脂质(LPO)含量测定
2.1 原理
脂质过氧化可以形成丙二醛、乙烷、共轭二烯、荧光产物及能产生化学发光的物质。如果这些产物在体液和组织中的含量增多，则表明体内脂质过氧化反应增强。
2.2 实验动物
种系 选用封闭群大鼠或小鼠
年龄 原则上用老龄鼠，通常选用20月龄大鼠、15月龄小鼠(相当于人60岁左右)
这一年龄段，作延缓衰老生化指标测定。
性别 雌雄均可，单一性别每组大鼠不少于8只，小鼠不少于10只。
分组 随机分为3个剂量组，1个老龄对照组，最好增设1个少龄对照组(大鼠3月龄，小鼠8周)，每组大鼠8只，小鼠10只。
剂量 人每公斤体重日推荐摄入量小鼠10倍，大鼠5倍，为其中1个剂量，另外2个剂量根据受试物的具体情况，在这个剂量基础上，上下浮动。
给受试物的时间 原则上1个月，必要时可延长至3个月。
途径 根据受试物性质而定，一般采用灌胃法、掺入饲料法、加入饮水法。
2.3 实验方法
2.3.1 血(或组织)中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定
2.3.1.1 原理
MDA(malondiadehycle)是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛(MDA)分子与2个硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。以波长515nm为激发光，在553nm有最强荧光强度，可用荧光法进行微量测定。
2.3.1.2 仪器与试剂
仪器 荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器
试剂 6.7g/L硫代巴比妥酸(TBA)－冰醋酸(1∶1)混合液
10mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液，4℃保存3个月)，临用前用甲醇稀释成
10nmol/mL
1/6mol/L硫酸
100g/L磷钨酸
正丁醇
无水乙醇
9g/L生理盐水
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂(选AR级)最好用双蒸水配制。
2.3.1.3 实验步骤
2.3.1.3.1 样品制备
全血样品 取血50μl加入1mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。
血清样品 取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。
组织匀浆样品 取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置玻璃匀浆器中，加入冷生理盐水，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10%组织匀浆(W/V)，4000r/min离心5～10min，取上清液待测。
2.3.1.3.2 标准曲线制作 将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、5nmol/mL分别取1mL加入TBA－冰醋酸(1∶1)混合液1mL－混匀，沸水浴75min→流水冷却至室温→5mL正丁醇振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液(正丁醇层)测荧光强度(狭缝10nm，波长激发光515nm，发射光553nm)以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
2.3.1.3.3 样品测定
血清20μl(或全血上清液0.5mL)(或组织匀浆上清液0.1mL)→加1/6mol/L硫酸4mL、100g/L磷钨酸0.5mL摇匀，室温放置5min→3000r/min离心10min，弃上清液→沉淀加1/6mol/L硫酸2mL，100g/L磷钨酸0.3mL摇匀，室温放置5min→3000r/min离心10min，弃上清液→沉淀用1mL蒸馏水振摇2min，再加TBA－冰醋酸(1：1)混合液1mL摇匀→95－100℃水浴75min(勿动！)→准时取出，流水冷却至室温→正丁醇5mL振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液(正丁醇层)4mL测定荧光强度(若出现混浊，可加一滴无水乙醇)。波长：Ex＝515nm，Em＝553nm，狭缝10nm，四乙氧基丙烷0.5nmol/mL为标准对照。
2.3.1.3.4 计算
测得荧光强度在标准曲线上可查得相应的MDA含量，然后换算成每mL血清(血液)或每mg组织中的过氧化脂质的含量。
公式：（略）
F：0.5nmol/mL四乙氧基丙烷荧光度
f：样品荧光度
2.3.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较，过氧化脂质含量降低经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试有降低脂质过氧化作用，试验结果阳性。若受试物组过氧化脂质含量降低接近少龄对照组，两者统计差异无显著性(P＞0.05〕，则说明该受试物具有较强的降低脂质过氧化作用。
2.3.2 组织中脂褐质(Lipofasci)含量测定
2.3.2.1 原理
脂褐素是丙二醛与游离氨基的物质(如磷脂酰乙醇胺、蛋白质及核酸)交联而生成的具有荧光的化合物，即shill碱，可以用氯仿与甲醇的混合液作萃取剂，将其从组织中提取出来进行测定，测定shill碱的含量，可知道细胞被自由基损伤的程度，间接反映体内脂质过氧化水平。
2.3.2.2 仪器和试剂
仪器 荧光分光光度计、组织匀浆器、离心机、紫外灯、恒温水浴锅
试剂 氯仿(AR)
甲醇(AR)
氯仿－甲醇混合液(2：1v/v)(新鲜配制)
0.1mol/L硫酸
硫酸奎宁标准液(0.1μg/mL0.1mol/L硫酸)
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥
2.3.2.3 实验步骤
取组织200mg，加入2∶1(v//v氯仿甲醇混合液4mL(w/v＝1∶20)，用匀浆器在45℃水浴中2500r/min匀化1min，制成以氯仿甲醇混合液为介质的5%匀浆。随后加入4mL蒸馏水，以2000r/min(匀浆器)充分混合1min，除去黄素干扰物，3000r/min离心10min后样品分为3层，上层为水相，中层为组织，下层为氯仿甲醇相。小心吸去水层，沿管壁穿过中层，将下层氯仿甲醇液取出，不可将水混入提取液中，若水混入提取液中，应再离心去除水。向氯仿甲醇提取液中加入甲醇0.2mL，轻轻振荡混匀，使之清澈透明，置紫外灯下照射30s，倒入石英杯中，测定荧光强度。
以硫酸奎宁(0.1μg/mL 0.1mol/L硫酸)为标准对照，在狭缝4.4，灵敏度3.6，激发波长360nm，放射波长450nm，其荧光强度为55－60U，在该条件下测定样品荧光强度。氯仿甲醇混合液为空白对照。
计算（略）
2.3.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较，脂褐质含量降低经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物有降低脂质过氧化作用，试验结果阳性，若受试物组脂褐质含量降低接近少龄对照组，两者统计差异无显著性(P＞0.05〕，则说明该受试物具有较强的降低脂质过氧化作用。
2.3.2.5 注意事项：
2.3.2.5.1 吸取氯仿层时要非常小心，以免带入组织颗粒和水，影响荧光测定。
2.3.2.5.2 荧光化合物的全部化学性质与特点不清楚，有些正常生化物质，如视黄醛和黄素类化合物也具有类似荧光产物的荧光光谱，黄素类物质是水溶性物质，水洗氯仿甲醇混合液，便可除去；视黄醛是脂溶性的，在氯仿中经紫外线照射后迅速降解，其它一些共轭多烯化合物，用紫外线照射也可除去。
2.3.2.5.3 丙二醛与自由氨基的交联反应较为缓慢，Schiff碱的形成是一个长时间的过程，不能立即反映自由基损伤反应的变化。因此，给予受试物的时间要长，一般2－3个月，长者可达6个月以上。
3 抗氧化酶含量及活力测定
3.1 原理
SOD催化超氧阴离子自由基(O2)生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－PX)和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O2对细胞的毒害作用。SOD、GSH－Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。
3.2 实验动物
种系 选用封闭群大鼠或小鼠
年龄 原则上用老龄鼠，通常选用20月龄大鼠、15月龄小鼠(相当于人60岁左右)这一年龄段，作延缓衰老生化指标测定。
性别 雌雄均可，单一性别每组大鼠不少于8只，小鼠不少于10只。
分组 随机分为3个剂量组，1个老龄对照组，最好增设1个少龄对照组(大鼠3月龄，小鼠8周)，每组大鼠8只，小鼠10只。
剂量 人每公斤体重日推荐摄入量小鼠10倍，大鼠5倍，为其中1个剂量，另外2个剂量根据受试物的具体情况，在这个剂量基础上，上下浮动。
给受试物的时间 原则上1个月，必要时可延长至3个月。
途径 根据受试物性质而定，一般采用灌胃法、掺入饲料法、加入饮水法。
3.3 实验方法
3.3.1 血(或组织)中超氧化物歧化酶(SOD)活力及含量测定
可任选下列方法之一
3.3.1.1 化学发光法
3.3.1.1.1 原理
黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化底物黄嘌呤或次黄嘌吟氧化生成尿酸的同时产生
与化学发光剂鲁米诺（氨基苯二酰肼）反应生成激发态的中间物，当中间物返回
基态时，以光辐射的能量产生发光现象，由于SOD能清除，所以抑制鲁米诺的化学发光，其抑制程度与酶活力大小有关。
3.3.1.1.2 试剂和仪器
仪器 生物化学发光仪、微量加样器
试剂 0.05mol/L碳酸盐缓冲液(含1×10－4mol/LEDTA)pH10.2
Na2CO3 3.68g
Na2CO3 1.28g
EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000mL，4℃储存1－2月
0.05mol/L磷酸盐缓冲液(含1×10－4mol/L EDTA)pH7.8
K2HPO4 7.970g
KH2PO4 0.579g
EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000mL，室温放置1周
1×10－4m0l/L黄嘌吟(Xanthine)
黄嘌呤3.8mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH10.2至250mL新鲜配制
1×10－4mol/L鲁米诺(Luminol)
鲁米诺4.45mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH10.2至250mL新鲜配制黄嘌呤－鲁米诺混合液(1∶1)
用前新鲜配制
黄嘌呤氧化酶＊(0.1mg/mL)
黄嘌呤氧化酶(46mg/mL)22 μl加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.810mL，用前新鲜配制。
＊ 黄嘌吟氧化酶也可根据酶活性大小配成适当浓度，以在发光仪上空白产生300－400mv的读数为宜。
超氧化物歧化酶标准品
3.3.1.1.3 实验步骤
SOD标准曲线制作 将标准品SOD用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释成2、4、6、8、10ng/mL，取不同浓度SOD液10μl，加黄嘌呤氧化酶10μl，再加鲁米诺－黄嘌呤混合液980μl测反应1min后6s的发光值(mv)，空白对照用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)10μl代替，以空白对照的发光强度为100.%，抑制发光程度为纵坐标，SOD浓度为横坐标，绘制曲线，求出抑制50%发光程度时SOD的浓度C50(ng/mL)
样品测定 取鼠血10μl加入到0.5mL双蒸水中，充分振摇使之溶血(1∶50)，待测。
按顺序加样，混匀后立即计时，测1min后6s的发光值(mv)或积分值。
计算 在25℃条件下，抑制50%发光程度时所需的SOD的浓度C50(ng/mL)为1个活力单位。
3.3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较，SOD活力升高经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物有升高SOD作用，试验结果阳性。若受试物组SOD升高接近少龄对照组，两者统计差异无显著性(P＞0.05〕，则说明该受试物具有较强的升高SOD作用。
3.3.1.1.5 注意事项
溶血液及黄嘌吟氧化酶的加样量可根据酶活性大小调整，但每次试验各组加样量要一致，最终反应体积为1mL，可在加混合液前用蒸馏水补齐。
SOD活力测定方法灵敏度的高低取决于pH和稳态浓度（即黄嘌呤氧化酶的量）。
3.3.1.2 羟胺法
3.3.1.2.1 原理
氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红
色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用发光光度法进行测定，当SOD消除后形成的亚硝酸盐减少。
3.3.1.2.2 仪器与试剂
仪器 721分光光度计、离心机、恒温水浴、匀浆器
试剂 1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8
10mmol/L盐酸羟胺
盐酸羟胺6.95mg，加水至10mL
7.5mmol/L黄嘌呤
黄嘌呤11.41mg，加水至10mL
0.023U/mL黄嘌呤氧化酶
25U/0.9mL黄嘌呤氧化酶8.4μl加pH7.8磷酸盐缓冲液至10mL
10g/L甲萘胺
3.3g/L对氨基苯磺酸
3g/L磺基水杨酸
SOD标准品
三氯甲烷
95%乙醇(v/v)
3.3.1.2.3 实验步骤
红细胞抽提液制备 50μl全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95%乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。
组织匀浆的制备 剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成10%组织匀浆，(最好用超声波发生器处理30s)，使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min，取上清液20μl待测。
＊A 所用样品的量
红细胞抽提液 5－10μl
血清(或血浆) 20μl
组织匀浆 5－10μl
SOD标准抑制曲线 将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL(1.5μg/mL)，用本法测定不同量的sOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。
50% 取液量
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/mL，乘以稀释倍数(1mL/取样量)。
若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。
3.3.1.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较，SOD活力升高经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物有升高SOD作用，试验结果阳性。若受试物组SOD升高接近少龄对照组，两者统计差异无显著性(P＞0.05)，则说明该受试物具有较强的升高SOD作用。
3.3.2 血(或组织)中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)活力测定
3.3.2.1 原理
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5，5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应在GSH－Px催化下可生成黄色的5－硫代2－硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GsH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
3.3.2.2 试剂和仪器
仪器 721分光光度计、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器
试剂 叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0
NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA－Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽(还原型GSH)溶液
GSH30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.25－1.5mmol/LH2O2溶液
取30%H2O20.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3 167g(先用蒸馏水溶解)
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/LNa2HPO4溶液：
Na2HPO422.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
拧檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
3.3.2.3 实验步骤
3.3.2.3.1 样品制备
血样稀释液 取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1∶100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置－20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻，按1∶100制备溶血液样品。
组织上清液 动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取1.0g组织，加9mL冷生理盐水，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min(低温高速离心机)，以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20%(v/v)甘油分装于塑料管，放置－20～－80℃，可保存数周，而酶活力不减。
3.3.2.3.2 GSH标准曲线的制作：
取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、10mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/LNa2HPO42.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
以GSH含量(μmol/L)为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。
3.3.2.3.4 计算
鼠全血GSH－Px活力单位规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log［GSH］降低后，使1og［GSH］降低1为一个酶活力单位。
组织GSH－Px比活力单位规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
* Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量
.3.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较，GSH－Px活力升高经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物有升高GsH－Px作用，试验结果阳性。若受试物组GSH－Px升高接近少龄对照组，两者统计差异无显著性(P＞0.05〕，则说明该受试物具有较强的升高GSH－Px作用。
3.3.2.5 注意事项
3.3.2.5.1 由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。
若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
3.3.2.5.2 5－硫代2－硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。
4 脑、肝组织中单胺氧化酶(MAO－B)活力测定
4.1 原理
人们发现哺乳动物中单胺氧化酶主要有2种形式，即MAO－A、MAO-B，其中MAO－B活性随增龄上升，与衰老关系密切。人45－60岁之后，脑内MAO－B活性急骤升高，使去甲肾上腺素和多巴胺的调节功能降低，而加速衰老过程。另一方面，单胺类物质是在肝脏进行降解，因此延缓衰老的食品，应对脑的MAO－B有显著的抑制作用，而对肝的MAO－B仅有轻微或没有抑制作用。
单胺氧化酶可催化各种单胺类化合物发生氧化脱氨反应，生成相应的醛、氨和过氧化氢。测定底物的消耗或产物的生成都可确定酶的活性。本方法以MAO－B的特异性底物盐酸苄胺为反应底物，测定其反应产物节醛的生成量。利用节醛在紫外部分λ＝242nm处有一吸收高峰，测定酶作用反应后的光吸收值，推算出MAO－B的酶活性。
4.2 试剂和仪器
仪器 组织研磨器、超声波细胞破碎机、低温高速离心机、恒温水浴振荡器、紫外分光光度计、混旋器。
试剂 0.2mol/L磷酸盐缓冲液
A液 0.2mol/L Na2HPO4溶液
Na2HPO4·12H2O 143.2g溶于2000mL双蒸水
B液 0.2mol/L KH2PO4溶液
KH2PO4 13.6g溶于500mL双蒸水
将A液1920mL、B液480mL，混匀后，pH7.4.
8mmol/L盐酸苄胺溶液
60%(v/v)高氯酸
环己烷
4.3 实验步骤
4.3.1 粗酶液制备 取适量脑组织、肝组织，分别加入10倍体积预冷的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，置玻璃匀浆器内冰浴匀浆，超声24kHz，每次20s，间歇30s，共2次，于0℃以下1000g离心10min，弃沉淀，上清液在4℃下17000g离心30min，弃上清，取其沉淀用0.2mol/L磷酸盐缓冲液重新悬浮，－20℃冰箱保存，不超过5d，最好当日测定。
4.3.2 测定步骤
为消除酶液中存在的单胺底物干扰，空白管在保温后，再加苄胺，采用Folin酚法测定酶液蛋白含量，以小牛血清白蛋白为标准蛋白。
4.3.3 计算
酶活性定义 为3h产生0.01个光吸收值改变的酶量为1个酶活性单位(U)，该光吸收值的改变相当于在37℃下生成1nmol/L的苄醛。
酶比活性单位表示为 △OD/mg蛋白·hr，其中△OD为测定样品光吸收值与空白管光吸收值之差。
4.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较，脑MAO－B活力降低经统计差异有显著性(P＜0.05)，肝MAO－B活力不降低或微降，可判定该受试物有降低脑MAO－B作用，试验结果阳性。若受试物组脑MAO－B降低接近少龄对照组，两者统计差异无显著性(P＞0.05〕，则说明该受试物具有较强的降低脑MAO－B作用。
4.5 注意事项
4.5.1 酶液制备的全过程均应严格遵守低温操作原则。
4.5.2 操作程序中的振荡，混合一定要充分有效。
4.5.3 玻璃器皿最好用10%硝酸浸泡几小时，用蒸馏水反复冲洗，烘干备用。
4.5.4 蛋白测定用比色杯要用无水乙醇冲洗，滤纸吸干。
【附1】Folin酚法测定蛋白含量
1 原理
蛋白质在碱性条件下与铜形成复合物，然后又与钨酸钠－钼酸钠化合物产生蓝色反应，在750nm有最大吸收。若蛋白质含量超过25μg/mL时，应在500nm测定。本法灵敏，可测出0.2μg/mL蛋白质。
2 仪器、试剂
仪器 721型分光光度计、恒温水浴、试管、吸量管(2mL、5mL)
试剂
试剂甲：使用前将4%Na2CO3和0.2mol/LNaOH等体积混合，1%CuSO4·5H2O和2%酒石酸钾钠等体积混合。然后将它们50∶1混合。只能当天使用。
试剂乙：(Folin酚试剂)：在2L的磨口回流装置内加入100g钨酸钠(Na2WO4·H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，700mL蒸馏水，再加50mL85%磷酸及100mL浓盐酸，充分混合后，以小火回流10h。再加入150g硫酸锂(LiSO4)，50mL蒸馏水及溴液数滴。然后开口继续沸腾15min，以便驱除过量的溴。冷却后定容到1L。过滤，滤液微呈绿色，至于棕色试剂瓶中冰箱保存。使用时用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂。而后适当稀释(约1倍)，使最终浓度为1N。贮存于冰箱可长期保存。
蛋白质标准液(预先用定氮法确定蛋白质纯度)：牛血清白蛋白(电泳纯)配成250μg/mL的水溶液。
3 实验步骤
3.1 绘制标准曲线
按0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL往各试管加入蛋白标准液，加双蒸水至1mL。各管加入试剂甲5mL混匀，30℃保温10min；加试剂乙0.5mL，快速混匀，30℃保温30min，于500nm测OD值。每种蛋白标准液浓度测2管，取平均值。以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.2 样品定量测定
3.3 计算
3.3.1 查标准曲线，求得蛋白质浓度(μg/mL)，可测定范围是25－250μg/mL蛋白质
3.3.2 标准液标准值对比
E0：对照液的OD值
Ex：待测液的OD值
Est：标准液的OD值
Cst：标准液的蛋白含量
V：稀释倍数
【附2】双缩脲法测定蛋白质含量(按试剂盒要求操作)
1 人群的选择
选45岁以上这一年龄段人群，排除经常服药、嗜酒、嗜烟者以及有脑、心、肝、肺、肾、血液病等器质性疾病所致功能障碍者。随机分为1个对照组和1个剂量组，每组30人(采用同龄对照加自身对照)，按厂家推荐量给予受试物1－3个月。
2 实验方法
2.1 血清中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定
2.1.1 原理
MDA(malondiadehycle)是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛(MDA)分子与2个硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。以波长515nm为激发光，在553nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。
2.1.2 仪器与试剂
仪器 荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管
试剂 6.7g/L硫代巴比妥酸(TBA)－冰醋酸(1∶1)混合液
10mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液，4℃保存3个月)，临用前用甲醇稀释成10nmol/mL 1/6mol/L硫酸
100g/L磷钨酸
正丁醇
无水乙醇
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸(v/v)浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂(选AR级)最好用双蒸水配制。
2.1.3 实验步骤
2.1.3.1 样品制备
全血样品 取血50μ1加入1mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。
血清样品 取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。 2.1.3.2 标准曲线制作将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、5nmol/mL分别取1mL加入TBA－冰醋酸(1∶1)混合液1mL→混匀，沸水浴75min→流水冷却至室温→5mL正丁醇振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液(正丁醇层)测荧光强度(峡峰10nm，波长激发光515nm，发射光553nm)以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
2.1.3.3 样品测定
血清20μ1(或全血上清液0.5mL)→加1/6mol/L硫酸4mL、100g/L磷钨酸0.5mL摇匀，室温放置5min→3000r/min离心10min，弃上清液→沉淀加1/6mol/L硫酸2mL，100g/L磷钨酸0.3mL摇匀，室温放置5min→3000r/min离心10min，弃上清液→沉淀用1mL蒸馏水振摇2min，再加TBA－冰醋酸(1∶1)混合液1mL摇匀→95－100℃水浴75min(勿动！)→准时取出，流水冷却至室温→正丁醇5mL振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液(正丁醇层)4mL测定荧光强度(若出现混浊，可加一滴无水乙醇)。波长：Ex＝515nm，Em＝553nm，狭缝10nm，四乙氧基丙烷0.5nmol/mL为标准对照。
2.1.3.4 计算
测得荧光强度在标准曲线上可查得相应的MDA含量，然后换算成每mL血清(血液)中的过氧化脂质的含量。 公式:
F：0.5nmol/mL四乙氧基丙烷荧光度
f：样品荧光度
2.2 血中超氧化物歧化酶(SOD)活力及含量测定
可任选下列方法之一
2.2.1 化学发光法
2.2.1.1 原理
黄嘌吟氧化酶在有氧条件下催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤氧化生成尿酸的同时产生
与化学发光剂鲁米诺（氨基苯二酰肼）反应生成激发态的中间物，当中间物返回
基态时，以光辐射的能量产生发光现象，由于SOD能清除 ，所以抑制鲁米诺的化学发光，其抑制程度与酶活力大小有关。
2.2.1.2 试剂和仪器
仪器 生物化学发光仪、微量加样器
试剂 0.05mol/L碳酸盐缓冲液(含1×10－4mol/L EDTA)pH10.2
Na2CO3 3.68g
NaHCO3 1.28g
EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000mL，4℃储存1－2月
0.05mol几磷酸盐缓冲液(含1×10－4mol/L EDTA)pH7.8
K2HPO4 7.970g
KH2PO4 0.579g
EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000mL，室温放置1周
1×10-4mol/L黄嘌呤(Xanthine)
黄嘌呤3.8mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH10.2至250mL新鲜配制
1×10－4mol/L鲁米诺(Luminol)
鲁米诺4.45mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH10.2至250mL新鲜配制
黄嘌呤－鲁米诺混合液(1∶1)
用前新鲜配制
黄嘌呤氧化酶＊(0.1mg/mL)
黄嘌呤氧化酶(46mg/mL)22μl加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.810mL，用前新鲜配制。
* 黄嘌吟氧化酶也可根据酶活性大小配成适当浓度，以在发光仪上空白产生300－400mv的读数为宜。
超氧化物歧化酶标准品
2.2.1.3 实验步骤
SOD标准曲线制作 将标准品SOD用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释成2、4、6、8、10ng/mL，取不同浓度SOD液10μl，加黄嘌呤氧化酶10μl，再加鲁米诺－黄嘌呤混合液980μl测反应1min后6s的发光值(mv)，空白对照用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)10μl代替，以空白对照的发光强度为100%，抑制发光程度为纵坐标，SOD浓度为横坐标，绘制曲线，求出抑制50%发光程度时SOD的浓度C50(ng/mL)
样品测定 取血10μl加入到0.5mL双蒸水中，充分振摇使之溶血(1∶50)，待测。
按顺序加样，混匀后立即计时，测1min后6s的发光值(mv)或积分值。
计算 在25℃条件下，抑制50%发光程度时所需的SOD的浓度C50(ng/mL)为1个活力单位。
2.2.1.4 注意事项
溶血液及黄嘌呤氧化酶的加样量可根据酶活性大小调整，但每次试验各组加样量要一致，最终反应体积为1mL，可在加混合液前用蒸馏水补齐。
2.2.2 羟胺法
2.2.2.1 原理
的亚硝酸盐减少。
2.2.2.2 仪器与试剂
仪器 721分光光度计、离心机、恒温水浴
试剂 1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8
10mmol/L盐酸羟胺
盐酸羟胺6.95mg，加水至10mL
7.5mmol/L黄嘌吟
黄嘌吟11.41mg，加水至10mL
0.023U/mL黄嘌呤氧化酶
25U/0.9mL黄嘌呤氧化酶8.4μl加pH7.8磷酸盐缓冲液至10mL
10g/L甲萘胺
3.3g/L对氨基苯磺酸
SOD标准品
三氯甲烷
95%乙醇
2.2.2.3 实验步骤
红细胞抽提液制备 50μ1全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95%乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。
样品测定
*A 所用样品的量
红细胞抽提液 5－10μl
血清(或血浆) 20μl
SOD标准抑制曲线将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL(1.5μg/mL)，用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SODU/mL，乘以稀释倍数(1mL/取样量)。
样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/gHb。
2.3 血中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)活力测定
2.3.1 原理
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5，5’－二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应在GSH－Px催化下可生成黄色的5－硫代2－硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GsH减少。
2.3.2 试剂和仪器
仪器 721分光光度计、恒温水浴锅、微量加样器、离心机
试剂 叠氮钠磷酸缓冲液p7.0
NaNL3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA－Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽(还原型GSH)溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.5－1.5mmol/L H2O2溶液
取30%H2O2 0.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3 16.7g(先用蒸馏水溶解)
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/LNa2HPO4溶液：
Na2HPO4 22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
2.3.3 实验步骤
2.3.3.1 样品制备
血样稀释液 取血20μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1∶100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置－20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻，按1∶100制备溶血液样品。
2.3.3.2 GSH标准曲线的制作：
取10mmoll/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、10mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/LNa2HPO42.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
以GSH含量(μmol/L)为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。
显色反应1min后于423nm波长(1cm光径)，读OD值，5min之内读数准确。
2.3.3.4 计算
全血GSH－Px活力单位 规定每8μl全血，在37℃反应5min，扣除非酶反应后，使GSH浓度降低1μmol/L浓度为一个酶活力单位。
全血GSH－Px活力U/mL血＝(非酶管OD－样品管OD)×A＊×5＊＊
**5 换算成1mL反应液中GSH浓度时，需乘以稀释倍数5
2.3.3.5 注意事项
2.3.3.5.1 由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。
若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
2.3.3.5.2 5－硫代2－硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。
2.4 数据处理与结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组过氧化脂质含量降低，超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶活性升高，与对照组比较，经统计差异有显著性(P＜0.05)，判定该受试物有抗氧化作用。 |
