1 主题内容与适用范围
本标准规定了牛乳及其制品、黄油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素M1与B1的测定方法。
本标准适用于牛乳及其制品、黄油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素M1与B1的测定。
2 引用标准
GB/T 5009.22食品中黄曲霉毒素B1的测定方法
3 原理
样品经提取、浓缩、薄层分离后，黄曲霉毒素M1与B1在紫外光(波长365nm)下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。
4 试剂
4.1 同GB/T 5009.22中第3章。
4.2 异丙醇。
4.3 硅胶G：层析用。
4.4 氯化钠及氯化钠溶液(40g/L)。
4.5 硫酸(1＋3)。
4.6 玻璃砂：用酸处理后洗净干燥，约相当20目。
4.7 黄曲霉毒素M1标准溶液：用三氯甲烷配制成每毫升相当于10μg的黄曲霉毒素M1标准溶液。以三氯甲烷作空白试剂，黄曲霉毒素M1的紫外最大吸收峰的波长应接近357nm，摩尔消光系数为19950。避光，置于4℃冰箱中保存。
4.8 黄曲霉毒素M1与B1混合标准使用液：用三氯甲烷配制成每毫升相当于各含0.04μg黄曲霉毒素M1与B1。避光，置于4℃冰箱中保存。
5 仪器
同GB/T 5009.22中第4章。
6 分析步骤
整个操作需在暗室条件下进行。
6.1 样品提取
6.1.1 样品提取制备表见下表。
提取液量可由式(1)计算。
式中：X1——提取液量，mL；
A——样品中的水分量，mL(牛乳、炼乳及猪组织的取样量为30g，牛乳粉、乳酪的取样量为15g)；
B——加水量，mL。
注：样品中的水分量参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编著的《食物成分表》。
因各提取液中含48mL甲醇，需39mL水才能调到甲醇与水之体积比为(55＋45)，因此加入氯化钠溶液(40g/L)量等于87mL减去提取液量(mL)。
6.1.2 牛乳与炼乳：称取30.00g混匀的样品，置于小烧杯中，再分别用90mL甲醇移于300mL具塞锥形瓶中，盖严防漏。振荡30min，用折叠式快速滤纸滤于100mL具塞量筒中。按上表收集62mL牛乳与52mL炼乳(各相当于16g样品)提取液。
6.1.3 牛乳粉：取15.00g样品，置于具塞锥形瓶中，加入20mL水，使样品湿润后再加入90mL甲醇，以下按6.1.2自“振荡30min”起，依法操作。按上表收集59mL提取液(相当于8g样品)。
6.1.4 乳酪：称取15.00g切细、过10目圆孔筛混匀样品，置于具塞锥形瓶中，加5mL水和90mL甲醇，以下按6.1.2自“振荡30min”起依法操作，按上表收集56mL提取液(相当于8g样品)。
6.1.5 黄油：称取10.00g样品，置于小烧杯中，用40mL石油醚将黄油溶解并移于具塞锥形瓶中。加45mL水和55mL甲醇，振荡30min后，将全部液体移于分液漏斗中。再加入1.5g氯化钠摇动溶解，待分层后，按上表收集80mL提取液(相当于8g样品)于具塞量筒中。
6.1.6 新鲜猪组织：取新鲜或冷冻保存的猪组织样品(包括肝、肾、血、瘦肉)，先切细，混匀后称取30.00g，置于小乳钵中，加玻璃砂少许磨细，新鲜全血用打碎机打匀，或用玻璃珠振摇抗凝。混匀后称取30.00g将各样品置于300mL具塞锥形瓶中，加入90mL甲醇，以下按6.1.2自“振荡30min”起依法操作。按上表收集59mL猪肝，61mL猪肾，58mL猪瘦肉及61mL猪血等提取液(各相当于16g样品)。
6.2 净化
6.2.1 用石油醚分配净化：将以上收集的提取液移入250mL分液漏斗中，再按各种食品加入一定体积的氯化钠溶液(40g/L)(见上表)。再加入40mL石油醚，振摇2min，待分层后，将下层甲醇氯化钠水层移于原量筒中，将上层石油醚溶液从分液漏斗上口倒出，弃去。再将量筒中溶液转移于原分液漏斗中。再重复用石油醚提取2次，每次30mL，最后将量筒中溶液仍移于分液漏斗中。黄油样液总共用石油醚提取2次，每次40mL。
6.2.2 用三氯甲烷分配提取：于原量筒中加入20mL三氯甲烷，摇匀后，再倒入原分液漏斗中，振摇2min。待分层后，将下层三氯甲烷移于原量筒中，再重复用三氯甲烷提取两次，每次10mL合并于原量筒中。弃去上层甲醇水溶液。
6.2.3 用水洗三氯甲烷层与浓缩制备：将合并后的三氯甲烷层倒回原分液漏斗中，加入30mL氯化钠溶液(40g/L)，振摇30s，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层三氯甲烷层收集于原量筒中。加入10g无水硫酸钠，振摇放置澄清后，将此液经装有少许无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于100mL蒸发皿中。氯化钠水层用10mL三氯甲烷提取一次，并经过滤器一并滤于蒸发皿中。最后将无水硫酸钠也一起倒于滤纸上，用少量三氯甲烷洗量筒与无水硫酸钠，也一并滤于蒸发皿中。于65℃水浴上通风挥干。用三氯甲烷将蒸发皿中残留物转移于浓缩管中。蒸发皿中残渣太多，则经滤纸滤入浓缩管中。于65℃用减压吹气法将此液浓缩至0.4mL以下，再用少量三氯甲烷洗管壁后，浓缩定量至0.4mL备用。
6.3 测定
6.3.1 硅胶G薄层板的制备：薄层板厚度为0.3mm，105℃活化2h，在干燥器内可保存1～2d。
6.3.2 点板：取5cm×20cm的薄层板两块，距板下端3cm的基线上各滴加两点，在距第一与第二板的左边缘0.8～1cm处各滴加10μL黄曲霉毒素M1与B1混合标准使用液，在距各板左边缘2.8～3cm处各滴加同一样液点(各种食品的滴加体积见上表)，在第二板的第2点上再滴加10μL黄曲霉毒素M1与B1混合标准使用液。一般可将薄层板放在盛有干燥硅胶的层析槽内进行滴加，边加边用冷风机冷风吹干。
6.3.3 展开。
6.3.3.1 横展：在槽内加入15mL事先用无水硫酸钠脱水的无水乙醚(500mL无水乙醚中加20g无水硫酸钠)。将薄层板靠近标准点的长边置于槽内，展至板端后，取出挥干，再同上继续展开一次。
6.3.3.2 纵展：将横展两次挥干后的薄层板再用异丙醇－丙酮－苯－正己烷－石油醚(沸程60～90℃)－三氯甲烷(5＋10＋10＋10＋10＋55)混合展开剂纵展至前沿距原点距离为10～12cm取出挥干。
6.3.3.3 再横展：将纵展挥干后的板再用乙醚横展1～2次，展开方法同6.3.3.1。
6.3.4 观察与评定结果：
6.3.4.1 在紫外光灯下将第一、二板相互比较观察，若第二板的第2点在黄曲霉毒素M1与B1标准点的相应处出现最低检出量(M1与B1的比移值依次为0.25和0.43)，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素M1与B1含量在其所定的方法灵敏度以下(见上表)。
6.3.4.2 如果第一板的相同位置上出现黄曲霉毒素M1与B1的荧光点，则第二板第2点的样液点是否各与滴加的标准点重叠，如果重叠，再进行以下的定量与确证试验。
6.3.5 稀释定量：样液中的黄曲霉毒素M1与B1荧光点的荧光强度与黄曲霉毒素M1与B1的最低检出量(0.0004μg)的荧光强度一致，则牛乳、炼乳、牛乳粉、乳酪与黄油样品中黄曲霉毒素M1与B1的含量依次为0.1，0.2，0.5，0.5及0.5μg/kg；新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉)样品均为0.2μg/kg(见上表)。
如样液中黄曲霉毒素M1与B1的荧光强度比最低检出量强，则根据其强度逐一进行测定，估计减少滴加微升数或经稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。
6.3.6 确证试验：在做完定性或定量的薄层板上，将要确证的黄曲霉毒素M1与B1的点用大头针圈出。喷以硫酸溶液(1＋3)，放置5min后，在紫外光灯下观察，若样液中黄曲霉毒素M1与B1点同标准点一样均变为黄色荧光，则进一步确证检出的荧光点是黄曲霉毒素M1与B1。
6.3.7 计算
式中：X2——黄曲霉毒素M1或B1含量，μg/kg；
V1——样液浓缩后体积，mL；
V2——出现最低荧光样液的滴加体积，mL；
D——浓缩样液的总稀释倍数；
m——浓缩样液中所相当的样品质量，g；
0.0004——黄曲霉毒素M1或B1的最低检出量，μg。
结果的表述：报告测定值的整数位。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
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