1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中合成着色剂的测定方法。
本标准适用于食品中合成着色剂的测定。
第一篇 高效液相色谱法(第一法)
2 原理
食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液－液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。最小检出量，新红5ng、柠檬黄4ng、苋菜红6ng、胭脂红8ng、日落黄7ng、赤藓红18ng、亮蓝26ng，当进样量相当0.025g时最低检出浓度分别为0.2mg//k；0.16mg/kg；0.24mg/kg；0.32mg/kg；0.28mg/k；0.72mg/k；1.04mg/k。
3 试剂
3.1 正己烷。
3.2 盐酸。
3.3 乙酸。
3.4 甲醇：经滤膜(0.5μm)过滤。
3.5 聚酰胺粉(尼龙6)：过200目筛。
3.6 乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。
3.7 氨水：量取氨水2mL，加水至100mL，混匀。
3.8 氨水－乙酸铵溶液(0.02mol/L)：量取氨水0.5mL，加乙酸铵溶液(0.02mol/L)至1000mL，混习。
3.9 甲醇－甲酸(6＋4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL，混匀。
3.10 柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，加水至100mL，溶解混匀。
3.11 无水乙醇－氨水－水(7＋2＋1)溶液：量取无水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混匀。
3.12 三正辛胺正丁醇溶液(5%)：量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混匀。
3.13 饱和硫酸钠溶液。
3.14 硫酸钠溶液(2g/L)。
3.15 pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH值到6。
3.16 合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度。配成水溶液(1.00mg/mL)。
3．17 合成着色剂标准使用液：临用时上述溶液（或将3．16）加水稀释20倍，经滤膜（0．45μm）过滤。配成每毫升相当50．0μg的合成着色剂。
4 仪器
高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。
5 分析步骤
5.1 样品处理
5.1.1 桔子汁、果味水、果于露汽水等：称取20．0～40．0g，放入100mL烧杯中。含二氧化碳样品加热驱除二氧化碳。
5.1.2 配制酒类：称取20．0～40．0g，放100mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。
5.1.3 硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取：5．00～10．00小粉碎样品，放入100mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液pH值较高，用柠檬酸溶液调pH值到6左右。
5.1.4 巧克力豆及着色糖衣制品：称取5．00～10．00g，放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。
5.2 色素提取
5.2.1 聚酞胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将1g聚酞胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次（含赤薛红的样品用5．2．2法处理），再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL经滤膜（0．45μm）过滤，取10μL进高效液相色谱仪。 5.2.2 液-液分配法（适用于含赤蹿红的样品）：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液（5％）10～20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取，至到有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL合并氨水溶液层（含水溶性酸性色素），用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL经滤膜（0．45μm）过滤，取10μL进高效液相色谱仪。
5.3 高效液相色谱参考条件
5.3.1 柱：YWG-Cl8 10μm不锈钢柱4．6mm（id）×250mm。
5.3.2 流动相：甲醇-0．02 mol／L乙酸铰溶液（pH=4）。
5.3.3 梯度洗脱：甲醇：20％～35％，3％／min；35％～98％，9％／min；98％继续6min。
5.3.4 流速：lmL／min。
5.3.5 紫外检测器，254nm波长。
5.4 测定
取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
5.5 计算
式中：X1——样品中着色剂的含量，g/kg；
m1——样液中着色剂的质量，μg；
V2——进样体积，mL；
V1——样品稀释总体积，mL；
m2——样品质量，g。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
5.6 允许差
相对相差≤10%。
5.7 其他
第二篇 薄层色谱法(第二法)
6 原理
水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。最低检出量为50μg，点样量为1g，样品最低检出浓度约为50mg/kg。
7 试剂
7.1 石油醚：沸程60～90℃。
7.2 甲醇。
7.3 聚酰胺粉(尼龙6)：200目。
7.4 硅胶G。
7.5 硫酸：(1＋10)。
7.6 甲醇－甲酸溶液：(6＋4)。
7.7 氢氧化钠溶液(50g/L)。
7.8 海沙：先用盐酸(1＋10)煮沸15min，用水洗至中性，再用氢氧化钠溶液(50g/L)煮沸15min，用水洗至中性，再于105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。
7.9 乙醇(50%)。
7.10 乙醇－氨溶液：取1mL氨水，加乙醇(70%)至100mL。
7.11 pH6的水：用柠檬酸溶液(20%)调节至pH6。
7.12 盐酸(1＋10)。
7.13 柠檬酸溶液(200g/L)。
7.14 钨酸钠溶液(100g/L)。
7.15 碎瓷片：处理方法同7.8。
7.16 展开剂
7.16.1 正丁醇－无水乙醇－氨水(1%)(6＋2＋3)：供纸色谱用。
7.16.2 正丁醇－吡啶－氨水(1%)(6＋3＋4)：供纸色谱用。
7.16.3 甲乙酮－丙酮－水(7＋3＋3)：供纸色谱用。
7.16.4 甲醇－乙二胺－氨水(10＋3＋2)：供薄层色谱用。
7.16.5 甲醇－氨水－乙醇(5＋1＋10)：供薄层色谱用。
7.16.6 柠檬酸钠溶液(25g/L)－氨水－乙醇(8＋1＋2)：供薄层色谱用。
7.17 合成着色剂标准溶液：按3.16方法，分别配制着色剂的标准溶液浓度为每毫升相当于1.0mg。
7.18 着色剂标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。
8 仪器
8.1 可见分光光度计。
8.2 微量注射器或血色素吸管。
8.3 展开槽，25cm×6cm×4cm。
8.4 层析缸。
8.5 滤纸：中速滤纸，纸色谱用。
8.6 薄层板：5cm×20cm。
8.7 电吹风机。
8.8 水泵。
9 分析步骤
9.1 样品处理
9.1.1 果味水、果子露、汽水：称取50.0g样品于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。
9.1.2 配制酒：称取100.0g样品于100mL烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。
9.1.3 硬糖、蜜饯类、淀粉软糖：称取5.00或10.0g粉碎的样品，加30mL水，温热溶解，若样液pH值较高，用柠檬酸溶液(200g/L)调至pH4左右。
9.1.4.1 奶糖：称取10.0g粉碎均匀的样品，加30mL乙醇－氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20mL，立即用硫酸溶液(1＋10)调至微酸性再加1.0mL硫酸(1＋10)，加1mL钨酸钠溶液(100g/L)，使蛋白质沉淀、过滤，用少量水洗涤，收集滤液。
9.1.4.2 蛋糕类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加海沙少许，混匀，用热风吹干用品(用手摸已干燥即可以)，加入30mL石油醚搅拌。放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，全部倒入G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇－氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，以下按9.1.4.1自“置水浴上浓缩至约20mL”起依法操作。
9.2 吸附分离
将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0.5～1.0g聚酰胺粉充分搅拌，用柠檬酸溶液(200g/L)调pH至4，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附着色剂的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤可以用水泵慢慢地抽滤)。用pH4的70℃水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲醇－甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇－氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇(50%)洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。
9.3 定性
9.3.1 纸色谱
取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3～10μL样品溶液、1～2μL着色剂标准溶液，挂于分别盛有7.16.1、7.16.2的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。
也可取0.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干后先定性后再供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用7.16.3展开剂。
9.3.2 薄层色谱
9.3.2.1 薄层板的制备
称取1.6g聚酰胺粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中备用。
9.3.2.2 点样
离板底边2cm处将0.5mL样液从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2μL色素标准溶液。
9.3.2.3 展开
苋菜红与胭脂红用7.16.4展开剂，靛蓝与亮蓝用7.16.5展开剂，柠檬黄与其他着色剂用7.16.6展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出，晾干，与标准斑比较，如Rf值相同即为同一色素。
9.4 定量
9.4.1 样品测定
将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。
将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇－氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移入10mL比色管中，加水至刻度，作比色用。
9.4.2 标准曲线制备
分别吸取0、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0mL胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL亮蓝、靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。
上述样品与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，靛蓝620nm)，测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。
9.5 计算
式中：X2——样品中着色剂的含量，g/kg；
m3——测定用样液中色素的质量，mg；
m4——样品质量(体积)，g(mL)；
V3——样品解吸后总体积，mL；
V4——样液点板(纸)体积，mL。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准第一法由天津市食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、宁夏回族自治区卫生防疫站、西安市卫生防疫站负责起草，第二法由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
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