前 言
本标准非等效采用国外标准。
本标准的附录A是提示的附录。
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准负责起草单位：卫生部食品卫生监督检验所；参加起草单位：河北省卫生防疫站、邯郸市卫生防疫站。
本标准主要起草人：杨祖英、李良学、焦淑婷、王平、贾丽华。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
1 范围
本标准规定了食品中诱惑红的测定方法。
本标准适用于糖果包衣等食品中诱惑红的测定。本方法的取样量10g时，最低检出限为25mg/kg。
2 原理
诱惑红在酸性条件下被聚酰胺粉吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。
3 试剂
3.1 石油醚：沸程30～60℃。
3.2 甲醇。
3.3 聚酰胺粉(尼龙6)：200目。
3.4 硫酸：1＋10。
3.5 氢氧化钠：50g/L。
3.6 海沙：先用盐酸(1＋10)煮沸15min，用水洗至中性，再用氢氧化钠(50g/L)煮沸15min，用水洗至中性，再于105℃干燥，贮于具塞瓶中保存，备用。
3.7 乙醇溶液：50%(V/V)。
3.8 乙醇－氨溶液：取2mL的氨水，加70%(V/V)乙醇至100mL。
3.9 pH6的水：用20%的柠檬酸调至pH6。
3.10 柠檬酸溶液：200g/L。
3.11 钨酸钠溶液：100g/L。
3.12 诱惑红的标准溶液：准确称取0.025g诱惑红，加水溶解，并定容至25mL，即得1mg/mL。
3.13 诱惑红的标准使用溶液：吸取诱惑红的标准溶液5.0mL于50mL容量瓶中，加水稀释到50mL，即得0.1mg/mL。
3.14 展开剂
3.14.1 丁酮＋丙酮＋水＋氨水(7＋3＋3＋0.5)。
3.14.2 正丁醇＋无水乙醇＋1%氨水(6＋2＋3)。
3.14.3 2.5%柠檬酸钠＋氨水＋乙醇(8＋1＋2)。
3.15 仪器
3.15.1 可见分光光度计。
3.15.2 微量注射器，10、50μL。
3.15.3 展开槽。
3.15.4 电吹风机。
3.15.5 滤纸：中速滤纸，纸色谱用。
3.15.6 恒温水浴锅。
3.15.7 台式离心机。
4 分析步骤
4.1 样品的处理
4.1.1 汽水：将样品加热去二氧化碳后，称取10.0g样品于烧杯中，然后用20%柠檬酸调pH呈酸性，加入0.5～1.0g聚酰胺粉吸附色素，将吸附色素的聚酰胺粉全部转到漏斗中过滤，用pH4的酸性热水洗涤多次(约200mL)，以洗去糖等物质。若有天然色素，用甲醇－甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70℃的水多次洗涤至流出液中性。洗涤过程必需充分搅拌然后用乙醇－氨溶液分次解吸色素，收集全部解吸液，于水浴上躯除氨，蒸发至2mL左右，转入5mL的容量瓶中，用50%的乙醇分次洗涤蒸发皿，洗涤液并入5mL的容量瓶中，用50%的乙醇定容至刻度。此液留作纸色谱用。
4.1.2 硬糖：称取10.0g的已粉碎的样品，加30mL的水，温热溶解，若样品溶液的pH值较高，用柠檬酸溶液(3.10)调至pH4左右。以下操作从“加入0.5～1.0g聚酰胺粉吸附色素”起，按4.1.1条操作。
4.1.3 糕点：称取10.0g已粉碎的样品，加入30mL石油醚提取脂肪，共提三次，然后用电吹风吹干，倒入漏斗中，用乙醇－氨溶液解吸色素，解吸液于水浴上蒸发至20mL，加入1mL的钨酸钠溶液沉淀蛋白，真空抽滤，用乙醇－氨溶液解吸滤纸上的诱惑红，然后将滤液于水浴上挥去氨，调pH呈酸性，以下从“加入0.5～1.0g聚酰胺粉吸附色素”起，按4.1.1条操作。
4.1.4 冰淇淋：称取10.0g已均匀的样品于烧杯中，加入20g海沙，15mL石油醚提取脂肪，提取2次，倾去石油醚，然后在50℃的水浴上挥去石油醚，再加入乙醇－氨溶液解吸诱惑红，解吸液倒入100mL的蒸发皿中，直至解吸液无色。将解吸液于水浴上挥去乙醇，使体积约为20mL时，加入1mL硫酸(1＋10)，1mL钨酸钠溶液沉淀蛋白，放置2min，然后用乙醇－氨溶液调至pH呈碱性，将溶液转入离心管中，5000r/min，离心15min，倾出上清液，于水浴上挥去乙醇，然后用柠檬酸溶液(3.10)调pH呈酸性，以下自“加入0.5～1.0g聚酰胺粉吸附色素”起，按4.1.1条操作。
4.2 定性
取色谱用纸，在距底边2cm起始线上分别点3～10μL的样品处理液、1mL色素标准液，分别挂于盛有3.14.1、3.14.2、3.14.3展开剂的展开槽中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出空气中晾干，与标准斑比较定性。
4.3 定量 4.3.1 标准曲线的制备
吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL诱惑红标准使用液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释到刻度。用1cm比色杯，以零管调零点，于波长500nm处，测定吸光度，绘制标准曲线。
4.3.2 样品的测定
取色谱用纸，在距离底边2cm的起始线上，点0.20mL样品处理液，从左至右点成条状。纸的右边点诱惑红的标准溶液1μL，依法展开，取出晾干。将样品的色带剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL的比色管中，加水稀释至刻度，混匀后，与标准管同时在500nm处，测定吸光度。
5 结果
5.1 计算：
式中：X——样品中的诱惑红的含量，g/kg；
A——测定用样品中诱惑红的质量，mg；
m——样品质量，g；
V1——样品解吸后总体积，mL；
V2——样品纸层析用体积，mL。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数字。
5.2 检出限：纸色谱最低检出限2μg。
方法最低检出限为25mg/kg，标准曲线线性范围为0～12mg/L，方法回收率为82%～99%，相对标准差为2.8%。
附录A
(提示的附录)
方法评价
A1 方法原理
样品中的诱惑红以聚酰胺粉吸附，经乙醇－氨溶液解析处理，用纸色谱进行分离后，与标准比较进行定性、定量。
A2 方法评价
本方法最低检出限为25mg/kg，添加到糖果、汽水、糕点、冰淇淋25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的诱惑红时，其平均回收率82%～99%，相对标准差为2.8%。
A2.1 展开剂的选择本标准试验了3种展开剂，即3.14.1，3.14.2和3.14.3。经试验，发现展开剂 3.14.1可以将诱惑红与目前我国允许使用的几种红色素分开。但不能分离诱惑红与亮蓝。展开剂 3.14.3可以分离诱惑红与亮蓝，见表A1。
表A1 展开剂分离着色剂情况表
A2.2 最大吸收波长的选择：以20μg/mL的诱惑红溶液，用1cm比色池，定波长440nm～560nm的吸光度，以吸光度为纵坐标，以波长(nm)为横坐标，画吸收曲线，求得诱惑红的最大吸收波长为500nm。
A2.3 诱惑红标准曲线：诱惑红在0～12mg/L的范围内符合浪泊－比尔定律，成直线，其线性关系的回归方程式为Y＝0.0023＋0.5132X，γ＝0.9999，α＝0.0023，b＝0.5132。
A3 方法验证结果
本标准委托河北省卫生防疫站、邯郸市卫生防疫站验证，验证单位为糖果、饮料、糕点、冰淇淋各加100mg/kg诱惑红，每种样品两个单位各测3份结果，测得回收率为83%～101%，其实验室间的重复性γ＝11.54，再现性R＝18.48，三个实验室所有数据经科克伦法和狄克逊法检验，未发现异常值，都可以接受。方法的精密度符合要求。
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