1 主题内容与适用范围
本标准规定了用荧光测定法测定食物中硫胺素含量的方法。
本标准适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响嚷嘧色素荧光物质的样品。
本方法的最小检出限为0.05μg。
2 原理
硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。
如样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。
3 试剂
3.1 正丁醇：优级纯或重蒸馏的分析纯。
3.2 无水硫酸钠：分析纯。
3.3 淀粉酶。
3.4 水：去离子水或蒸馏水。
3.5 0.1mol/L盐酸：8.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。
3.6 0.3mol/L盐酸：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。
3.7 2mol/L乙酸钠溶液：164g无水乙酸钠或2728含水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL。
3.8 25%氯化钾溶液：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL。
3.9 25%酸性氯化钾溶液：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL。
3.10 15%氢氧化钠溶液：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL。
3.11 1%铁氰化钾溶液：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存。
3.12 碱性铁氰化钾溶液：取4mL 1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用。
3.13 3%乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
3.14 活性人造浮石：称取100g经40目筛的人造浮石，以10倍于其容积的3%热乙酸搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的25%热氯化钾搅洗15min；然后再用3%热乙酸搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存。
3.15 硫胺素标准贮备液：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。此溶液每毫升相当0.1mg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。
3.16 硫胺素标准中间液：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。
3.17 硫胺素标准使用液：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，此溶液每毫升相当0.1μg硫胺素。用时现配。
3.18 0.04%澳甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL 0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。
4 仪器设备
4.1 实验室常用仪器设备。
4.2 荧光分光光度计。
4.3 Maizel－Gerson反应瓶：如图1所示。
4.4 盐基交换管：如图2所示。
5 操作步骤
5.1 试样处理
样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用
5.2 提取
5.2.1 精确称取一定量试样(估计其硫胺素含量约为10～30μg，一般称取5～20g试样)，置于150mL三角瓶中，加入50～75mL 0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解10.3×10 4Pa(151b/in2)30min，凉后取出。
5.2.2 用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5(以0.04%溴甲酚绿为外指示剂)。
5.2.3 按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于45～50℃温箱过夜保温(约16h)。
5.2.4 冷至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。
5.3 净化
5.3.1 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。
5.3.2 用移液管加入提取液20～80mL(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2～5μg)。
5.3.3 加入约10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。
5.3.4 加入25%酸性氯化钾(温度为90℃左右)20mL，收集此液于25mL刻度试管内。冷至室温，用25%酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。
5.3.5 重复5.3.1～5.3.4，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。
5.4 氧化
5.4.1 将5mL试样净化液分别加入A、B两个Maizel－Gerson反应瓶。
5.4.2 在避光暗环境中将3mL 15%氢氧化钠加入反应瓶A，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇，准确计时1.5min。
5.4.3 重复5.4.1～5.4.2，用标准净化液代替试样净化液。
5.4.4 用黑布遮盖A、B反应瓶，静置分层后弃去下层碱性溶液，加入2～3g无水硫酸钠使溶液脱水。
5.5 荧光强度的测定
5.5.1 荧光测定条件：
激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。
5.5.2 依次测定下列荧光强度：
a. 试样空白荧光强度(试样反应瓶A)；
b. 标准空白荧光强度(标准反应瓶A)；
c. 试样荧光强度(试样反应瓶B)；
d. 标准荧光强度(标准反应瓶B)。
6 计算
式中：X——样品中硫胺素含量，mg/100g；
U——试样荧光强度；
Ub——试样空白荧光强度；
S——标准荧光强度；
Sb——标准空白荧光强度；
c——硫胺素标准使用液浓度，μg/mL；
V——用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL；
V1——试样水解后定容之体积，mL；
V2——试样用于净化的提取液体积，mL；
m——试样质量，g；
7 结果的允许误差
同一实验室同时或重复两次测定结果的相对偏差绝对值≤10%。
附加说明：
本标准由中华人民共和国卫生部卫生监督司提出，食品卫生标准分委员会审查通过。
本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。
本标准主要起草人王光亚、张宏伟。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
GB/T 12390—1990
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