1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中环己基氨基磺酸钠的三种测定方法——气相色谱法、比色法、薄层层析法。
本标准气相色谱法及比色法适用于饮料、凉果等食品中环己基氨基磺酸钠的测定；薄层层析法适用于饮料、果汁、果酱、糕点中环己基氨基磺酸钠的含量测定，样品中含有0.1g/kg环己基氨基磺酸钠即可检出，最低检出量为3～4μg环己基氨基磺酸钠。
第一篇 气相色谱法
2 原理
在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯 ，利用气相色谱法进行定性和定量。
3 试剂
本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯(AR)，水为蒸馏水。
3.1 正己烷。
3.2 氯化钠。
3.3 层析硅胶(或海砂)。
3.4 50g/L亚硝酸钠溶液。
3.5 100g/L硫酸溶液。
3.6 环己基氨基磺酸钠标准溶液(含环己基氨基磺酸钠＞98%)：精确称取1.0000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠10mg。
4 仪器
4.1 气相色谱仪附氢火焰离子化检测器。
4.2 旋涡混合器。
4.3 离心机。
4.4 10μL微量注射器。
4.5 色谱条件
4.5.1 色谱柱：长2m，内径3mm，U形不锈钢柱。
4.5.2 固定相：Chromosorb W AW DMCS 80～100目，涂以10% SE－30。
4.5.3 测定条件
柱温：80℃；汽化温度：150℃；检测温度：150℃。
流速：氮气40mL/min；氢气30mL/min；空气300mL/min。
5 样品处理
5.1 液体样品：摇匀后直接称取。含二氧化碳的样品先加热除去，含酒精的样品加40g/L氢氧化钠溶液调至碱性，于沸水浴中加热除去，制成试样。
5.2 固体样品：凉果、蜜饯类样品将其剪碎制成试样。
6 分析步骤
6.1 试料制备
6.1.1 液体试样：称取20.0g试样于100mL带塞比色管，置冰浴中。
6.1.2 固体试样：称取2.0g已剪碎的试样于研钵中，加少许层析硅胶(或海砂)研磨至呈干粉状，经漏斗倒入100mL容量瓶中，加水冲洗研钵，并将洗液一并转移至容量瓶中，加水至刻度，不时摇动，1h后过滤，即得试料，准确吸取20mL于100mL带塞比色管，置冰浴中。
6.2 测定
6.2.1 标准曲线的制备：准确吸取1.00mL环己基氨基磺酸钠标准溶液于100mL带塞比色管中，加水20mL，置冰浴中，加入5mL 50g/L亚硝酸钠溶液，5mL 100g/L硫酸溶液，摇匀，在冰浴中放置30min，并经常摇动，然后准确加入10mL正己烷，5g氯化钠，摇匀后置旋涡混合器上振动1min(或振摇80次)，待静止分层后吸出己烷层于10mL带塞离心管中进行离心分离，每毫升己烷提取液相当1mg环己基氨基磺酸钠，将标准提取液进样1～5μL于气相色谱仪中，根据响应值绘制标准曲线。
6.2.2 样品管按6.2.1自“加入5mL 50g/L亚硝酸钠溶液……”起依法操作，然后将试料同样进样1～5μL，测得响应值，从标准线图中查出相应含量。
7 计算
式中：X——样品中环己基氨基磺酸钠的含量，g/Kg；
m——样品质量，g；
V——进样体积，μL；
10——正己烷加入量，mL；
A——测定用试料中环己基氨基磺酸钠的含量，μg。
8 精密度和允许误差
重复测定变异系数＜7%。
两次平行测定相对允许误差绝对值≤10%，平行测定结果用算术平均值表示，保留二位小数。
第二篇 比色法
9 原理
在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，与磺胺重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色染料，在550nm波长测其吸光度，与标准比较定量。
10 调试剂
10.1 三氯甲烷。
10.2 甲醇。
10.3 透析剂：称取0.5g二氯化汞和12.5g氯化钠于烧杯中，以0.01mol/L盐酸溶液定容至100mL。
10.4 10g/L亚硝酸钠溶液。
10.5 100g/L硫酸溶液。
10.6 100g/L尿素溶液(临用时新配或冰箱保存)。
10.7 100g/L盐酸溶液。
10.8 10g/L磺胺溶液：称取1g磺胺溶于10%盐酸溶液中，最后定容至100mL。
10.9 1g/L盐酸萘乙二胺溶液。
10.10 环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取0.1000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解，最后定容至100mL，此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠1mg。
临用时将环己基氨基磺酸钠标准溶液稀释10倍。此液每毫升含环己基氨基磺酸钠0.1mg。
11 仪器
11.1 分光光度计。
11.2 旋涡混合器。
11.3 离心机。
11.4 透析纸。
12 试样处理
同第5章。
13 分析步骤
13.1 提取
13.1.1 液体试料：称取10.0g试料于透析纸中，加10mL透析剂，将透析纸口扎紧，放入盛有100mL水的200mL广口瓶内，加盖，透析20～24h得透析液。
13.1.2 固体试料：准确吸取10.0mL经“6.1.2”处理后的试料提取液于透析纸中，以下操作按“13.1.1”项下进行。
13.2 测定
13.2.1 取2支50mL带塞比色管，分别加入10mL透析液和10mL标准液，于0～3℃冰浴中，加入 1mL 10g/L亚硝酸钠溶液，1mL 100g/L硫酸溶液，摇匀后放入冰水中不时摇动，放置1h，取出后加15mL三氯甲烷，置旋涡混合器上振动1min，静置后吸去上层液，再加15mL水，振动1min，静止后吸去上层液，加10mL 100g/L尿素溶液，2mL 100g/L盐酸溶液，再振动5min，静置后吸去上层液，加15mL水，振动1min，静置后吸去上层液，分别准确吸出5mL三氯甲烷于2支25mL比色管中。另取一支25mL比色管加入5mL三氯甲烷作参比管。
于各管中加入15mL甲醇，1mL 10g/L磺胺，置冰水中15min，取出回复常温后加入1mL 1g/L盐酸萘乙二胺溶液，加甲醇至刻度，在15～30℃下放置20～30min，用1cm比色杯于波长550n用处测定吸光度，测得吸光度A及As。
13.2.2 另取2支50mL带塞比色管，分别加入10mL水和10mL透析液，除不加10g/L亚硝酸钠外，其他按“13.2.1”项下进行，测得吸光度Aso及Ao。
14 计算
式中：X——样品中环己基氨基磺酸钠的含量，g/kg；
m——样品质量，g；
V——透析液用量，mL；
c——标准管浓度，μg/mL；
As——标准液吸光度；
Aso——水的吸光度；
A——试料透析液吸光度；
Ao——不加亚硝酸钠的试料透析液吸光度。
15 精密度和允许误差
重复测定变异系数＜10%。
两次平行测定相对允许误差绝对值≤10%，平行测定结果用算术平均值表示，保留二位小数。
第三篇 薄层层析法
16 原理
样品经酸化后，用乙醚提取，将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开，经显色后，根据薄层板上环己基氨基磺酸的比移值及显色斑点深浅，与标准比较进行定性、概略定量。
17 试剂
除另有规定外，所用的试剂为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度水。
17.1 异丙醇。
17.2 正丁醇。
17.3 石油醚：沸程30～60℃。
17.4 乙醚(不含过氧化物)。
17.5 氢氧化胺。
17.6 无水乙醇。
17.7 氯化钠。
17.8 硫酸钠。
17.9 c(HCl)＝6mol/L盐酸：取50mL盐酸加到少量水中，再用水稀释至100mL。
17.10 聚酰胺粉(尼龙－6)：200目。
17.11 环己基氨基磺酸标准溶液：精密称取0.0200g环己基氨基磺酸，用少量无水乙醇溶解后移入10mL容量瓶中，并稀释到刻度，此溶液每毫升相当于2mg环己基氨基磺酸，二周后重新配制(环己基氨基磺酸的熔点：169～170℃)。
17.12 展开剂
17.12.1 正丁醇－浓氨水－无水乙醇(20＋1＋1)。
17.12.2 异丙醇－浓氨水－无水乙醇(20＋1＋1)。
17.13 显色剂：称取0.040g溴甲酚紫溶于100mL 50%乙醇溶液，用1.2mL 0.4%氢氧化钠溶液调至pH8。
18 仪器
18.1 吹风机。
18.2 层析缸。
18.3 玻璃板：5cm×20cm。
18.4 微量注射器：10μL。
18.5 玻璃喷雾器。
19 分析步骤
19.1 样品提取
19.1.1 饮料、果酱：称取2.5g(mL)已经混合均匀的样品(汽水需加热去除二氧化碳)，置于25mL带塞量筒中，加氯化钠至饱和(约1g)，加0.5mL c(HCl)＝6mol/L盐酸酸化，用15、10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，静止分层，用滴管将上层乙醚提取液通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中，用少量乙醚洗无水硫酸钠，加乙醚至刻度，混匀。吸取10.0mL乙醚提取液分两次置于10mL带塞离心管中，在约40℃水浴上挥发至干，加入0.1mL无水乙醇溶解残渣，备用。
19.1.2 糕点：称取2.5g糕点样品，研碎，置于25mL带塞量筒中，用石油醚提取3次，每次20mL，每次振摇3min，弃去石油醚，让样品挥干后(在通风橱中不断搅拌样品，以除去石油醚)，加入0.5mLc(HCl)＝6mol/L盐酸酸化，再加约1g氯化钠，以下按19.1.1自“用15、10mL乙醚提取2次……”起依法操作。
19.2 测定
19.2.1 聚酰胺粉板的制备：称取4g聚酰胺粉，加1.0g可溶性淀粉，加约14mL水研磨均匀合适为止，立即倒入涂布器内制成面积为5cm×20cm，厚度为0.3mm的薄层板6块，室温干燥后，于80℃干燥1h，取出，置于干燥器中保存、备用。
19.2.2 点样：薄层板下端2cm的基线上，用微量注射器于板中间点4μL样品液，两侧各点2μL、3μL环己基氨基磺酸标准液。
19.2.3 展开与显色：将点样后的薄层板放入预先盛有展开剂(17.12.1或17.12.2)的展开槽内，展开槽周围贴有滤纸，待溶剂前沿上展至10cm以上时，取出在空气中挥干，喷显色剂其斑点成黄色，背景为蓝色。样品中环己基氨基磺酸的量与标准斑点深浅比较定量(用17.12.2展开剂时，环己基氨基磺酸的比移值约为0.47，山梨酸0.73，苯甲酸0.61，糖精0.31)。
20 计算
式中：X——样品中环己基氨基磺酸钠的含量，g/Kg或g/L；
A——样品点相当于环己基氨基磺酸的质量，mg；
m——样品质量，g；
V1——加入无水乙醇的体积，mL；
V2——测定时点样的体积，mL；
10——测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；
25——样品乙醚提取液总体积，mL；
1.12——1.00g环己基氨基磺酸相当环己基氨基磺酸钠的质量，g。
21 精密度
重复测定变异系数≤28%。
本方法可以同时测定山梨酸、苯甲酸、糖精等成分。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由广州市卫生防疫站、广东省卫生防疫站、卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
本标准第一、二篇主要起草人张暖民、江月碧、吕澳生、梁立文、刘燕霞。
本标准第三篇主要起草人杨祖英、崔宏、蒋罗章、焦淑婷、易再明。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
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