|
1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中苯并(a)芘的测定方法。
本标准适用于食品中苯并(a)芘的测定。
样品量为50g，点样量为1g时，方法最低检出浓度为1ng/g。
2 原理
样品先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提取液经液－液分配或色谱柱净化，然后在乙酰化滤纸上分离苯并(a)芘，因苯并(a)芘在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点，将分离后有苯并(a)芘的滤纸部分剪下，用溶剂浸出后，用荧光分光光度计测荧光强度与标准比较定量。
3 试剂
3.1 苯：重蒸馏。
3.2 环己烷(或石油醚，沸程30～60℃)：重蒸馏或经氧化铝柱处理无荧光。
3.3 二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
3.4 无水乙醇：重蒸馏。
3.5 乙醇(95%)。
3.6 氢氧化钾。
3.7 丙酮：重蒸馏。
3.8 石油醚(60～90℃)：重蒸。
3.9 甲酸(88%～90%)。
3.10 无水硫酸钠：120℃烤2h以上。
3.11 咖啡因甲酸溶液(150g/L)：称咖啡因(医用或试剂用)15g，溶于适量甲酸中，再稀释至100mL。
3.12 甲酸(40%)。
3.13 硫酸钠溶液(20g/L)。
3.14 脱脂棉：用二氯甲烷回流4h以上。
3.15 展开剂：乙醇(95%)－二氯甲烷(2∶1)。
3.16 硅镁型吸附剂：将60～100目筛孔的硅镁吸附剂经水洗四次(每次用水量为吸附剂质量的4倍)于垂融漏斗上抽滤干后，再以等量的甲醇洗(甲醇与吸附剂量克数相等)，抽滤干后，吸附剂铺于干净瓷盘上，在130℃干燥5h后，装瓶贮存于干燥器内，临用前每100g加5g水减活，混匀并平衡4h以上，最好放置过夜。
3.17 层析用氧化铝(中性)：120℃活化4h。
3.18 乙酰化滤纸：将中速层析用滤纸裁成30cm×4cm的条状，逐条放入盛有乙酰化混合液(180mL苯、130mL乙酸酐、0.1mL硫酸)的500mL烧杯中，使滤纸充分地接触溶液，保持溶液温度在21℃以上，时时搅拌，反应6h，再放置过夜。取出滤纸条，在通风橱内吹干，再放入无水乙醇中浸泡4h，取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上，在室温内风干压平备用，一次可处理滤纸15～18条。
3.19 苯并(a)芘标准溶液：精密称取10.0mg苯并(a)芘，用苯溶解后移入100mL棕色容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于苯并(a)芘100μg。放置冰箱中保存。
3.20 苯并(a)芘标准使用液：吸取1.00mL苯并(a)芘标准溶液置于10mL容量瓶中，用苯稀释至刻度，同法依次用苯稀释，最后配成每毫升相当于1.0及0.1μg苯并(a)芘两种标准使用液，放置冰箱中保存。
4 仪器
4.1 脂肪提取器。
4.2 层析柱：10～15mm，长350mm，上端有内径25mm，长80～100mm内径漏斗，下端具有活塞。
4.3 层析缸(筒)。
4.4 K－D全玻璃浓缩器。
4.5 紫外光灯：带有波长为365nm或254nm的滤光片。
4.6 回流皂化装置：锥形瓶磨口处连接冷凝管。
4.7 组织捣碎机。
4.8 振荡器：装有自制木架，每次可摇6个分液漏斗。
4.9 微量注射器：25μL、50μL。
4.10 荧光分光光度计。
5 分析步骤
5.1 荧光分光光度法
5.1.1 样品提取
5.1.1.1 粮食或水分少的食品：称取40.0～60.0g粉碎过筛的样品，装入滤纸筒内，用70mL环己烷润湿样品，接收瓶内装6～8g氢氧化钾、100mL乙醇(95%)及60～80mL环己烷，然后将脂肪提取器接好，于90℃水浴上回流提取6～8h，将皂化液趁热倒入500mL分液漏斗中，并将滤纸筒中的环己烷也从支管中倒入分液漏斗，用50mL乙醇(95%)分二次洗接收瓶，将洗液合并于分液漏斗。加入100mL水，振摇提取3min，静置分层(约需20min)，下层液放入第二分液漏斗，再用70mL环己烷振摇提取一次，待分层后弃去下层液，将环己烷层合并于第一分液漏斗中，并用6～8mL环己烷淋洗第二分液漏斗，洗液合并。用水洗涤合并后的环己烷提取液三次，每次100mL，三次水洗液合并于原来的第二分液漏斗中，用环己烷提取二次，每次30mL，振摇0.5min，分层后弃去水层液，收集环己烷液并入第一分液漏斗中，于50～60℃水浴上，减压浓缩至40mL，加适量无水硫酸钠脱水。
5.1.1.2 油脂
5.1.1.2.1 植物油
称取20.0～25.0g的混匀油样，用100mL环己烷分次洗入250mL分液漏斗中，以环己烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次，每次40mL，振摇1min，合并二甲基甲酰胺提取液，用40mL经二甲基甲酰胺饱和过的环己烷提取一次，弃去环己烷液层。二甲基甲酰胺提取液合并于预先装有240mL硫酸钠溶液(20g/L)的500mL分液漏斗中，混匀，静置数分钟后，用环己烷提取二次，每次100mL，振摇3min，环己烷提取液合并于第一个500mL分液漏斗。也可用二甲基亚砜代替二甲基甲酰胺。
用40～50℃温水洗涤环己烷提取液二次，每次100mL，振摇0.5min，分层后弃去水层液，收集环己烷层，于50～60℃水浴上减压浓缩至40mL。加适量无水硫酸钠脱水。
5.1.1.2.2 甲酸－咖啡因净化提取法(适用于油脂)
称取混匀油样10.00g，用90mL石油醚分数次转入100mL分液漏斗中，用甲酸提取三次，每次10mL，于振荡器上振摇2min，静置分层，弃去下层甲酸。石油醚层以咖啡因－甲酸溶液(150g/L)萃取三次，每次10mL，振摇3min，静置分层，待彻底澄清后，仔细将咖啡因提取液(注意切勿带入醚层或乳化层)转入300mL具塞锥形瓶中，加120mL硫酸钠溶液(20g/L)稀释，加50mL石油醚猛烈振摇4min，转入250mL分液漏斗中，静置分层，下层再转入原锥形瓶中，加50mL石油醚重提一次，合并两次石油醚提取液，加20mL甲酸(40%)，摇1min，弃去甲酸水溶液(除去残留的咖啡因)，将石油醚提取液通过无水硫酸钠(约35g)的漏斗，脱水，转入K－D浓缩器中，减压浓缩至近干，以少量环己烷冲洗导管，混匀，吹氮(或室温挥发)定容至0.2mL，密塞、避光、冷藏保存，备用。
本法无需再过柱净化，以下按5.1.3操作。
5.1.1.3 鱼、肉及其制品：称取50.0～60.0g切碎混匀的样品，再用无水硫酸钠搅拌(样品与无水硫酸钠的比例为1∶1或1∶2，如水分过多则需在60℃左右先将样品烘干)，装入滤纸筒内，然后将脂肪提取器接好，加入100mL环己烷于90℃水浴上回流提取6～8h，然后将提取液倒入250mL分液漏斗中，再用6～8mL环己烷淋洗滤纸筒，洗液合并于250mL分液漏斗中，以下按5.1.1.2自“以环己烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次”起依法操作。
5.1.1.4 蔬菜：称取100.0g洗净、晾干的可食部分的蔬菜，切碎放入组织捣碎机内，加150mL丙酮，捣碎2min。在小漏斗上加少许脱脂棉过滤，滤液移入500mL分液漏斗中，残渣用50mL丙酮分数次洗涤，洗液与滤液合并，加100mL水和100mL环己烷，振摇提取2min，静置分层，环己烷层转入另一500mL分液漏斗中，水层再用100mL环己烷分二次提取，环己烷提取液合并于第一个分液漏斗中，再用250mL水，分二次振摇、洗涤，收集环己烷于50～60℃水浴上减压浓缩至25mL，加适量无水硫酸钠脱水。
5.1.1.5 饮料(如含二氧化碳先在温水浴上加温除去)：吸取50.0～100.0mL样品于500mL分液漏斗中，加2g氯化钠溶解，加50mL环己烷振摇1min，静置分层，水层分于第二个分液漏斗中，再用50mL环己烷提取一次，合并环己烷提取液，每次用100mL水振摇、洗涤二次，收集环己烷于50～60℃水浴上减压浓缩至25mL，加适量无水硫酸钠脱水。
5.1.1.6 糕点类：称取50.0～60.0g磨碎样品，装于滤纸筒内，以下按5.1.1.1自“用70mL环己烷湿润样品”起依法操作。
在5.1.1.1、5.1.1.3～5.1.1.6各项操作中，均可用石油醚代替环己烷，但需将石油醚提取液蒸发至近干，残渣用25mL环己烷溶解。
5.1.2 净化
5.1.2.1 于层析柱下端填入少许玻璃棉，先装入5～6cm的氧化铝，轻轻敲管壁使氧化铝层填实、无空隙，顶面平齐，再同样装入5～6cm的硅镁型吸附剂，上面再装入5～6cm无水硫酸钠，用30mL环己烷淋洗装好的层析柱，待环己烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭活塞。
5.1.2.2 将样品环己烷提取液倒入层析柱中，打开活塞，调节流速为每分钟1mL，必要时可用适当方法加压，待环己烷液面下降至无水硫酸钠层时，用30mL苯洗脱，此时应在紫外光灯下观察，以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止，如30mL苯不足时，可适当增加苯量。收集苯液于50～60℃水浴上减压浓缩至0.1～0.5mL〔可根据样品中苯并(a)芘含量而定，应注意不可蒸干〕。
5.1.3 分离
5.1.3.1 在乙酰化滤纸条上的一端5cm处，用铅笔划一横线为起始线，吸取一定量净化后的浓缩液，点于滤纸条上，用电吹风从纸条背面吹冷风，使溶剂挥散，同时点20μL苯并(a)芘的标准使用液(1μg/mL)，点样时斑点的直径不超过3mm，层析缸(筒)内盛有展开剂，滤纸条下端浸入展开剂约1cm，待溶剂前沿至约20cm时取出阴干。
5.1.3.2 在365或254nm紫外光灯下观察展开后的滤纸条，用铅笔划出标准苯并(a)芘及与其同一位置的样品的蓝紫色斑点，剪下此斑点分别放入小比色管中，各加4mL苯加盖，插入50～60℃水浴中不时振摇，浸泡15min。
5.1.4 测定
5.1.4.1 将样品及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英杯中，以365nm为激发光波长，以365～460nm波长进行荧光扫描，所得荧光光谱与标准苯并(a)芘的荧光光谱比较定性。
5.1.4.2 与样品分析的同时做试剂空白，包括处理样品所用的全部试剂同样操作，分别读取样品、标准及试剂空白于波长406、406＋5、406－5nm处的荧光强度，按基线法由式(1)计算所得的数值，为定量计算的荧光强度。
5.1.5 计算
式中：X1——样品中苯并(a)芘的含量，μg/kg；
m1——苯并(a)芘标准斑点的质量，μg；
F——标准的斑点浸出液荧光强度，mm；
F1——样品斑点浸出液荧光强度，mm；
F2——试剂空白浸出液荧光强度，mm；
V1——样品浓缩液体积，mL；
V2——点样体积，mL；
m2——样品质量，g。
结果的表述：报告测定结果至小数一位。
5.1.6 允许差
相对相差≤20%。
5.2 目测法
5.2.1 测定
吸取5，10，15，20或50μL样品浓缩液［可根据样品中苯并(a)芘含量而定］10，20μL及苯并(a)芘标准使用液(0.1μg/mL)，点于同一条乙酰化滤纸上，按5.1.3.1展开，取出阴干。
于暗室紫外灯下目测比较，找出相当于标准斑点荧光强度的样品浓缩液体积，如样品含量太高，可稀释后再重点，尽量使样品浓度在两个标准斑点之间。
5.2.2 计算
式中：X2——样品中苯并(a)芘的含量，μg/kg；
m3——样品斑点相当苯并(a)芘的质量，μg；
V1——样品浓缩总体积，mL；
V2——点样体积，mL；
m2——样品质量，g。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由辽宁省卫生防疫站、江苏省卫生防疫站、北京市卫生防疫站、广西壮族自治区卫生防疫站、上海市卫生防疫站、新疆维吾尔自治区卫生防疫站负责起草。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
